Способ моделирования хронического остеомиелита

Изобретение относится к экспериментальной медицине для моделирования хронического остеомиелита длинных костей конечностей.

На сегодняшний день вопрос лечения остеомиелита остается весьма актуальным. В общей структуре заболеваний опорно-двигательного аппарата хронический остеомиелит составляет 10-25%, а частота неудовлетворительных результатов лечения и рецидивов данного заболевания составляет до 40%. Постоянно разрабатываются и совершенствуются способы хирургического лечения, требующие создания новых экспериментальных моделей остеомиелита.

Известен способ моделирования остеомиелита (Патент RU № 2622369). Для этого в асептических условиях создают полость в метаэпифизарной зоне кости лабораторного животного, находящегося под наркозом. В эту полость вносят турунду, смоченную 1% раствором этоксисклерола, и фрагменты аутокости с последующим инфицированием полости культурой золотистого стафилококка. Инфицирование проводят на 7-е сутки путем введения в полученную полость кусочка суточной культуры золотистого стафилококка в 2% растворе агар-агара. При этом отверстие в кости запломбировывают эркодонт-цементом и рану засыпают порошком амоксиклава. На 31-е сутки после внесения микробной культуры развивается хронический остеомиелит.

Недостатком данного способа является его трудоемкость, обусловленная двухэтапностью выполнения, а также увеличение стоимости эксперимента за счет используемых медикаментов (этоксисклерол, эркодонт-цемент).

Известен способ моделирования остеомиелита Доценко И. А. (Патент RU № 2578818). В качестве носителя авторы использовали лавсановую ткань, контаминированную штаммом патогенного микроорганизма путем выдерживания полоски лавсановой ткани в суспензии возбудителя 1.5 McF(1×10⁸ КОЭ). После размещения полоски в дефекте кости его герметизировали костным воском и рану послойно ушивали. Удаление полоски производили на 7-е сутки.

Недостатком данного способа является необходимость дополнительного оперативного вмешательства с целью удаления бактериального носителя, а использование хирургического воска может обострять инфекционный процесс, приводить к септическим осложнениям и гибели животного.

В качестве прототипа выбран способ моделирования хронической гнойной костной раны (Патент RU 2499295), включающий формирование костного дефекта вдоль оси кости, помещение в него смеси культуры музейного штамма Staphylococcus Aureus №5 в количестве 40-45 млн KОЕ на 1 кг массы тела экспериментального животного и 0,1 мл стерильного кварцевого песка. Через трое суток после операции удаляют некротические массы и гной из зоны костного дефекта, снимают три операционных шва в средней трети раны, формируя свищевую рану. Выполняют реинфицирование раны той же культурой в дозе 20-25 млн KОЕ на 1 кг массы тела. В последующем сохраняют рану в свищевом виде.

Недостатком вышеописанного способа является необходимость двухэтапного вмешательства с дополнительным инфицированием раны, невозможность полного удаления носителя (кварцевый песок) Staphylococcus Aureus из раны. Размер сформированного дефекта формируется на усмотрение исследователя, поэтому можно сказать «размер дефекта не стандартизирован», что в последующем приводит к искажению данных, получаемых экспериментатором, отсутствию воспроизводимости получаемых результатов при использовании модели.

Задачей изобретения является создание модели хронического остеомиелитического процесса, имеющего патоморфологическое сходство с остеомиелитическим процессом у человека, позволяющей длительное время поддерживать этот процесс, со стандартизированным размером дефекта для получения воспроизводимых результатов при использовании в экспериментах, направленных на изучение вариантов лечения.

Техническим результатом предложенного способа является создание модели хронического остеомиелитического процесса, имеющего патоморфологическое сходство с остеомиелитическим процессом у человека, лишенного недостатков аналогов и прототипа.

Технический результат достигается тем, что в способе моделирования хронического остеомиелита, включающем формирование костного дефекта, введение в него инфицирующего агента, удаление на третий день после оперативного вмешательства части швов из средней трети раны и разведение её краев для инициирования свищевого хода, формируют стандартизированный костный дефект округлой формы, вводят предварительно импрегнированную микробной взвесью аллокость.

Предпочтительно стандартизированный костный дефект формируют четырехгранным конусовидным сверлом диаметром 0,5 см с ограничителем на глубину 0,5 см.

Предпочтительно аллокость импрегнируют путем погружения аллогенной кости весом 1 грамм на 15 минут в раствор микробной взвеси с концентрацией микробных клеток Staphylococcus aureus 6*10⁸ КОЕ/мл по стандарту для оптической стандартизации бактерий 1 МакФарланда (McF), с плотностью раствора 1 г/мл.

Предпочтительно используют Staphylococcus aureus ATCC 29213, выращенный на плотной питательной среде в течение 24 часов.

Предпочтительно моделирование хронического остеомиелита завершают на 21 сутки.

Способ осуществляют следующим образом. Положение животного на спине. Выполняют комбинированное обезболивание. По внутренней поверхности проксимальной трети голени удаляют волосяной покров, производят трехкратную обработку операционного поля 0,5% спиртовым раствором хлоргексидина. Выполняют разрез кожи 2,0 см, с последующим острым и тупым доступами через все слои мягких тканей к проксимальному метаэпифизу большеберцовой кости. Выполняют гемостаз раны. Затем формируют стандартизированный костный дефект. В частности, дефект формируют четырехгранным конусовидным сверлом диаметром 0,5 см с ограничителем на глубину 0,5 см. В зону дефекта погружают предварительно импрегнированную микробной взвесью аллокость, подготовленную путем погружения аллогенной кости весом 1 грамм на 15 минут в раствор микробной взвеси с концентрацией микробных клеток 6×10⁸ КОЕ/мл по стандарту для оптической стандартизации бактерий 1 МакФарланда (McF), с плотностью раствора 1 г/мл. Производят послойное ушивание раны. На 3-й день после оперативного вмешательства производят удаление части швов из средней трети раны и разведение её краев для инициирования свищевого хода. Наблюдают за животным в течение 21 дня.

Пример 1.

Выписка из протокола эксперимента №16. Кролик породы «Шиншилла», самец, масса 2,5 кг. Под комбинированным обезболиванием препаратами «Золетил 50» в дозе 15 мг/кг в/м, «Ксила» в дозе 0,1 мг/кг в/м и местной анестезией 0,25% раствором новокаина - 4 мл в положении животного на спине по внутренней поверхности проксимальной трети голени удалили волосяной покров, произвели трехкратную обработку операционного поля 0,5% спиртовым раствором хлоргексидина и выполнили 2,0 см разрез кожи с последующим острым и тупым доступами через все слои мягких тканей к проксимальному метаэпифизу большеберцовой кости. Выполнили гемостаз раны. Затем сформировали стандартизированный костный дефект четырехгранным конусовидным сверлом диаметром 0,5 см с ограничителем на глубину 0,5 см. В зону дефекта погрузили 1 грамм предварительно подготовленной инфицированной микробной взвесью аллокости. Произвели послойное ушивание раны. Выполнили компьютерную томографию с целью послеоперационного контроля (Фиг. 1).

Для подготовки импрегнированной аллокости фрагмент аллогенной кости весом 1 грамм погружали на 15 минут в раствор микробной взвеси с концентрацией микробных клеток 6×10⁸ КОЕ/мл по стандарту для оптической стандартизации бактерий 1 МакФарланда (McF) с плотностью раствора 1 г/мл. Проводили контрольное взвешивание (Весы лабораторные ВК 300.1). Определяли массу поглощенной жидкости на 1 грамм кости и концентрацию микробных клеток в ней. 1 грамм кости поглощал 0,01 грамм раствора микробной взвеси с концентрацией микробных клеток 1,0×10⁸ КОЕ/МЛ подтвержденный данными бактериологических посевов по методу серийных разведений. На 3-й день после оперативного вмешательства производили удаление части швов из средней трети раны и разведение её краев для инициирования свищевого хода.

У животного после операции наблюдалось снижение аппетита, физической активности, истощение, повышение температуры, нарушение функции оперированного сегмента. На 21-й день в области послеоперационной раны имелся незаживающий свищевой ход, с обильным гнойным отделяемым творожистой консистенции (Фиг. 2). По данным компьютерной томографии, выполненной на 21 день после операции, в проксимальном метаэпифизе большеберцовой кости визуализировалась полость с неровными склерозированными краями, заполненная костными секвестрами. Кортикальный слой неравномерно утолщен. Отек прилежащих мягких тканей, окружающих очаг, с наличием свищевого хода (Фиг.3). По данным лабораторных исследований в общем анализе крови была отмечена тенденция к снижению гемоглобина, эритроцитов и повышению лейкоцитов. По данным бактериологического исследования был выявлен рост монокультуры Staphylococcus aureus.

На 21 день животное выведено из эксперимента. В гистологических препаратах (Окраска гематоксилин-эозином, ×200) костный дефект с участками некроза и выраженной лейкоцитарной инфильтрацией (Фиг.4), фрагментами расплавляющейся костно-хрящевой ткани (Фиг.5), разрастанием соединительной ткани, окружающей очаг хронического гнойного воспаления (Фиг.6), с участками некроза и выраженной инфильтрацией сегментоядерными нейтрофилами, формирование свищевого хода (Фиг.7), что подтверждает формирование хронического остеомиелита.

Таким образом, предложенный способ моделирования хронического остеомиелита позволяет избежать генерализации остеомиелитического процесса, обеспечивает выживаемость животных на всем сроке эксперимента, в том числе за счет точного дозирования инфицирующего агента, завершить моделирование на 21 день, прост в техническом исполнении, смоделированный процесс соответствует патоморфологическими изменениям характерным для человека. Локализация дефекта минимизирует риск развития гнойного процесса в окружающие мягкие ткани и полость сустава. Стандартизированный размер дефекта позволяет получать воспроизводимые результаты при использовании в экспериментах, направленных на изучение вариантов лечения остеомиелита.