Результат интеллектуальной деятельности: ИММУНОМОДУЛЯТОР

Изобретение относится к синтетическим иммуномодуляторам на основе хлорароматического производного мочевины и может быть использовано в качестве модулятора функциональной активности иммунной системы и ее клеточных элементов.

Функциональная активность иммунной системы, и иммунокомпетентных клеток в частности, играет важную роль в организме на всех этапах онтогенеза (Ярилин А.А. Иммунология. М.: Медицина, 2013, 288 с; Маркова Е.В., Аникеева О.С. Влияние иммунокомпетентных клеток на формирование поведенческого стереотипа в онтогенезе. В мире научных открытий, 2015, №2 (62), С. 154-170). Нарушение функционирования иммунной системы является существенным звеном патогенеза многих заболеваний, оказывая негативное влияние на их течение, утяжеляя клиническую картину, снижая эффективность терапии (Markova E.V., Knyazeva М.А., Kozlov V.A. Immune parameters in mice with aggressive and depressive-like behavior. Applied and Fundamental Studies Proceedings of the 1st International Academic Conference. Edited by Yan Maximov. 2012. C. 21-27; Маркова E.B., Савкин И.В., Климова Т.В. Нейроиммунные механизмы психосоматической патологии. Симбирцев А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека. Издательство Фолиант, 2018, 512 с.) В патогенезе эпилепсии и других заболеваний нервной системы, сопровождающихся судорогами, а также алкоголизма, нарушение функциональной активности иммунной системы и иммунокомпетентных клеток, в частности, также играет существенную роль. Поэтому возникла необходимость исследовать влияние известных антиконвульсантов на функцию клеточных элементов иммунной системы в норме и при патологии.

Известно, что производные мочевины обладают широким спектром биологической активности, в том числе противосудорожной и ферментиндуцирующей (Химико-фармацевтический журнал, N 6, 1976, с. 63-66).

Известны оптически активные изомеры α-этилфенилацетилмочевины, применяемые для лечения эпилепсии и подобных состояний, не имеющие по существу никаких седативных, снотворных или возбудительных свойств.

Препараты содержат оптически активные изомеры α-этилфенилацетилмочевины вместе с одним или несколькими лекарственными средствами, имеющими снотворное и/или седативное действие (GB 864536, A61K 31/17, 1961).

Известны соединения N-арил-N'-(3-метил или этил-4-оксотиазолидинилиден) мочевины), которые обладают противосудорожной активностью и полезны при лечении эпилепсии (US 4402964, C07D 277/54, 1983).

Известны соединения N-арил-N'-(2-тиазолидинилиден) мочевины, которые обладают противосудорожной активностью и полезны при лечении эпилепсии (US 4542144, C07D 277/58, 1985).

Известен класс производных глицилмочевины, которые используют для лечения дисфункций ЦНС, таких как эпилепсия и судорожные расстройства (US 5288905, С07С 275/50, 1994).

Известно применение N-(2,6-дизамещенных фенил)-N'-3- и 4-пиридинилмочевины и их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Такие соединения, как моногидрохлорид N-(2-хлор-6-метилфенил)-N'-4-пиридинилмочевины или N-(2,3-дихлорфенил)-N-4-пиридинилмочевина, используются для лечения нейродегенеративных расстройств, перинатальной асфиксии, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза. Указанное изобретение относится к таким же новым применениям известных противосудорожных соединений, как ралитолин, фенитоин, ламотригин, тетродотоксин, лидокаин и карбамазепин (WO 9418972, A61K 31/165, 1994).

Известны соединения, содержащие ацилмочевину и композиции, содержащие их, и их использование в лечении неврологических заболеваний и расстройств, таких как эпилепсия, нейропатическая боль, биполярное расстройство, эпилептический статус, химически индуцированные судороги и/или приступы судорог, фебрильные состояния судорог, нарушения обмена веществ. Также предусматривается использование этих и других соединений, содержащих ацилмочевину, при лечении неврологических заболеваний и расстройств (US 2010280124, A61K 31/17, 2010).

Все описанные производные мочевины обладают противосудорожным действием.

Собственно бензгидрилмочевина также обладает выраженной противосудорожной активностью, сравнительно низкой острой токсичностью, но при длительном применении вызывает нежелательные побочные эффекты (RU 2024501, С07С 275/50, 1994). Поэтому были исследованы производные бензгидрилмочевины, которые этих недостатков не имеют.

В связи с этим описаны гликозиды бензгидрилмочевины, проявляющие противосудорожную активность (SU 675790, С07С 127/15, 1982).

Представляет интерес вещество мета-хлорбензгидрилмочевина (в другой редакции может обозначаться как - мета-хлордифенилметилмочевина).

Известны вещества относящиеся к оптическим изомерам (+) и (-) - бензгидрилмочевины и (+) и (-) - 1-[(3-хлорфенил) фенилметила] мочевины, фармацевтической композиции на их основе и способа получения указанных оптических изомеров для их использования на основе различной терапевтической активности, где радикалы выбраны из группы, включающей водород, алкил, галоген, нитро, амино, алкиламино и гидроксигруппы и расположены в орто-, пара- или мета-положениях бензольных колец. Эти вещества обладают противосудорожным действием (RU 2537361, С07С 275/18, A61K 31/17, 2013; US 2016244404, С07С 273/18, 2016).

Известно вещество мета-хлордифенилмочевина, которое применяется как антиаритмическое и противосудорожное средство в медицине (RU 1334658, С07С 273/18, 1995).

Известно лекарственное вещество - мета-хлордифенилметилмочевина, которое является оригинальным отечественным антиконвульсантом и рекомендовано Фармкомитетом СССР к медицинскому применению в качестве противоэпилептического средства под названием галодиф (RU 2092478, С07С 275/24, 1997; RU 2569684, С07С 275/24, С07С 273/18, 2015).

Известно применение мета-хлорбензгидрилмочевины в качестве средства, снижающего алкогольную мотивацию. Средство снижает потребление этилового алкоголя и выраженность патологического влечения к этанолу. (RU 2155034, A61K 31/17, 2000).

Известен способ реабилитации больных алкоголизмом при абстинентном синдроме. Для этого при проведении фармакотерапии дополнительно вводят мета-хлордифенилметилмочевину в дозе 100 мг 3 раза в день курсом 21 день. Способ позволяет достичь устойчивого лечебного эффекта, выражающегося в снижении выраженности патологического влечения к алкоголю, при наличии различной степени выраженности аффективных расстройств за счет нормотимолептического, аналгезирующего и вегетостабилизирующего эффектов (RU 2436573 A61K 31/17, 2011)..

Мета-хлорбензгидрилмочевина (мета-хлордифенилметилмочевина) повышает нейромедиацию гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в мозге, обладая модуляторным действием на нейрональные рецепторы, в частности ГАМК_А/БД-рецепторную систему, что может являться механизмом указанных выше свойств соединения (Шушпанова Т.В. и др. Влияние антиконвульсанта мета-хлор-бензгидрилмочевины (м-хБГМ) на бензодиазепиновую рецепторную систему мозга крыс при экспериментальном алкоголизме. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013, Т. 156, №. 12, С. 779-785).

Учитывая наличие функциональных ГАМК_А рецепторов на поверхности клеток иммунной системы, в частности. Т-лимфоцитов (Alam S. et al. Human peripheral blood mononuclear cells express GABAA receptor subunits //Molecular immunology, 2006, T. 43, №. 9, C. 1432-1442; Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л. Психонейроиммуномодуляция: поведение и иммунитет. Роль "нейромедиаторной установки мозга". 2009; Mendu S.К. et al. Increased GABAA channel subunits expression in CD8+ but not in CD4+ T cells in BB rats developing diabetes compared to their congenic littermates. Molecular immunology, 2011, T. 48, №. 4, C. 399-407), можно предположить, что мета-хлорбензгидрилмочевина, аналогично эффектам на нейрональных клетках, может вызывает модуляцию функциональной активности клеток иммунной системы.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать мета-хлорбензгидрилмочевину в качестве иммуномодулятора, в том числе и при хроническом алкоголизме.

Сущность изобретения заключается в том, что при изучении влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на пролиферативную активность клеток иммунной системы в норме и при патологии (хронический алкоголизм) in vivo и in vitro и интенсивность гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа показан иммуномодулирующий эффект.

В работе использовали половозрелых мышей-самцов (СВА × C57BI/6)F1 здоровых и в состоянии экспериментального хронического алкоголизма.

Экспериментальные животные были получены из одного питомника и рандомизированы по возрасту и массе тела. До и в период проведения эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии, в одинаковых условиях в стандартных пластиковых клетках 40×20×20 не более 10 особей в клетке с подстилкой из мелкой древесной стружки на стандартном рационе и при нормальном световом режиме. Все исследования проводились в одно и то же время суток (с 10 до 14 часов). Исследования проводились в соответствии с правилам, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и правилами лабораторной практики (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003, N 267).

Пример 1. Определение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на функциональную активность клеток иммунной системы в норме in vitro.

Изучение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на функциональную активность клеток иммунной системы в норме проводили in vitro добавлением соединения в культуральную среду при тестировании спонтанной и митогениндуцированной пролиферативной активности лимфоидных клеток селезенки, взятых от интактных (здоровых) мышей. Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 д. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: мета-хлорбензгидрилмочевину (10 мкг/мл); субоптимальные концентрации ЛПС E.coli 055:В5 (Sigma) и конкавалина А (Pharmacia), которые составляли соответственно 20 мкг/мл и 3 мкг/мл и/или культуральную среду до полного объема 150 мкл на лунку. Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании CO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКю на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации: (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты представлены в таблице 1.

Результаты, представленные в таблице 1, демонстрируют модулирующий эффект мета-хлорбензгидрилмочевины на пролиферативную активность спленоцитов интактных мышей, а именно, повышение спонтанной пролиферации, усиление стимулирующего действия Т-клеточного митогена (Конканавалин А) и снижение эффекта В-клеточного митогена (ЛПС).

Пример 2. Определение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на функциональную активность клеток иммунной системы при патологии (хроническом алкоголизме) in vitro.

Изучение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на функциональную активность клеток иммунной системы при патологии (хроническом алкоголизме) проводили in vitro добавлением соединения в культуральную среду при тестировании спонтанной и Т-митогениндуцированной пролиферативной активности лимфоидных клеток селезенки, взятых у мышей в состоянии хронического алкоголизма. Для моделирования хронического алкоголизма у мышей-самцов (СВА×C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 д. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: мета-хлорбензгидрилмочевину (10 мкг/мл); субоптимальную концентрацию конканавалина А (Кон A) (Pharmacia), которая составляла 3 мкг/мл и/или культуральную среду до полного объема 150 мкл на лунку. Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании CO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКю на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации: (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты, представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, при хроническом алкоголизме спленоциты отличаются нарушенной функциональной активностью, проявляющейся в сочетании повышенной спонтанной пролиферации клеток на фоне их низкой чувствительности к митогену. Результаты, представленные в таблице 2, демонстрируют способность мета-хлорбензгидрилмочевины снижать спонтанную пролиферативную активность спленоцитов мышей в состоянии хронического алкоголизма и восстанавливать чувствительность спленоцитов к стимулирующему действию Т-клеточного митогена практически до уровня, характерного для здоровых (интактных) животных.

Пример 3. Определение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на функциональную активность спленоцитов при патологии (хроническом алкоголизме) in vitro в присутствии гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК).

Изучение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на функциональную активность клеток иммунной системы in vitro в присутствии ГАМК проводили добавлением соединения в культуральную среду при тестировании спонтанной пролиферативной активности клеток селезенки, взятых у мышей в состоянии хронического алкоголизма.

Для моделирования хронического алкоголизма у мышей-самцов (СВА×C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 д. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: ГАМК (10 мкг/мл) изолированно и в присутствии мета-хлорбензгидрилмочевины (10 мкг/мл). Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании CO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКю на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенилоксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации: (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты, представлены в таблице 3.

Результаты, представленные в таблице 3, демонстрируют повышение мета-хлорбензгидрилмочевиной пролиферативной активности спленоцитов в присутствии ГАМК при хроническом алкоголизме. Это свидетельствует в пользу того, что мета-хлорбензгидрилмочевина, аналогично эффектам на нейрональных клетках, вызывает модуляцию функциональной активности клеток иммунной системы через прямое воздействие на ГАМК_А/БДР рецептурную систему на поверхности клеток иммунной системы.

Пример 4. Определение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на интенсивность гуморального иммунного ответа при патологии (хронического алкоголизма) in vivo.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма у мышей-самцов (СБА×C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Затем животные подвергались курсовому (10 дней), введению мета-хлорбензгидрилмочевины в действующей концентрации 100 мг/кг массы тела в сутки в виде суспензии на 1% крахмальной слизи внутрижелудочно, по окончании которого оценивалась интенсивность гуморального иммунного ответа по количеству антителообразующих клеток селезенки (АОК). Определение количества АОК проводилось модифицированным методом A.J. Cunningham (Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells. Nature, 1965, N 207, P. 1106-1107) на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации ЭБ по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде. Для этого селезенку измельчали ножницами в бюксе со средой 199, взвесь кусочков ткани несколько раз пропускали с помощью шприца через стальную иглу. Полученную суспензию клеток фильтровали. Конечный объем суспензии доводили до 5 мл. Работы проводили при температуре +4°С. Равные объемы клеточной суспензии, 10% суспензии ЭБ и раствора комплемента смешивали в бюксе и заливали в стеклянные камеры. Камеры были изготовлены следующим образом: между двумя предметными стеклами прокладывали полоску бумаги, а верхние и нижние края склеивали между собой горячим парафином. Когда парафин остывал, полоску бумаги вынимали и в щель между стеклами шприцем заливали смесь из 0,5 мл клеточной суспензии, 0,5 мл ЭБ (10% суспензии) и 0,5 мл комплемента.

Комплемент готовили непосредственно перед заливкой камеры. Учитывали объем суспензии, залитой в камеры. Заполненные камеры инкубировали в течение 45 минут в термостате при температуре 37°С. После инкубации подсчитывали количество локальных зон гемолиза в камере под бинокулярной лупой (увеличение в 20 раз). Зона гемолиза (бляшка) представляет собой округлый участок, почти полностью свободный от эритроцитов. Учитывая число бляшек в камере, количество ядросодержащих клеток в 1 мл клеточной суспензии, объем заполненной камеры и клеточность селезенки. Подсчет ядросодержащих клеток селезенки производили в камере Горяева. Оценивали относительное (на 10⁶ ядросодержащих клеток селезенки) число АОК.

В качестве контроля использовались здоровые животные соответствующего возраста, которые содержались с экспериментальной группой мышей в аналогичных условиях, но не принимали алкоголь.

После курсового (10 дней) введения мета-хлорбензгидрилмочевины у животных в состоянии хронического алгкоголизма регистрировалось повышение гуморального иммунного ответа, оцененное по относительному числу антителообразующих клеток селезенки. На рисунке 1 представлен гуморальный иммунный ответ мышей (CBA×C57BI/6)F1 в состоянии хронического алкоголизма и после курсового приема мета-хлорбензгидрилмочевины: по оси ординат отображено относительное количество антителообразующих клеток селезенки (на 10⁶ ядросодержащих клеток селезенки).

1-я группа столбиков (светлые столбики) - контрольная группа здоровых животных; 2-я группа столбиков (темные столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма; 3-я группа столбиков (серые столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма после курсового приема мета-хлорбензгидрилмочевины.

n=12-15 в каждой группе животных.

р<0,01 - между мышами в состоянии хронического алкоголизма и контрольной группой здоровых животных;

р<0,01 между мышами в состоянии хронического алкоголизма до и после мета-хлорбензгидрилмочевины.

Таким образом, сниженный при хроническом алкоголизме гуморальный иммунный ответ в результате курсового приема мета-хлорбензгидрилмочевины повышается до уровня, характерного для здоровых животных соответствующего возраста.

Пример 5. Определение влияния мета-хлорбензгидрилмочевины на интенсивность клеточного иммунного ответа при патологии (хронического алкоголизма) in vivo.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма у мышей-самцов (СВА×C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Затем животные подвергались курсовому (10 дней), введению мета-хлорбензгидрилмочевины в действующей концентрации 100 мг/кг массы тела в сутки в виде суспензии на 1% крахмальной слизи внутрижелудочно, по окончании которого оценивалась интенсивность клеточного иммунного ответа по выраженности развиваемой реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на введение Т-зависимого антигена (эритроцитов барана). Для этого мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (0,5%-0,5 мл.). Разрешающую дозу указанного антигена (50%-0,05 мл.) вводили под апоневроз задней стопы через 96 часов. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 часа после разрешающей инъекции по степени опухания лапы (изменения ее толщины по сравнению с позитивно-контрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда RPMI-1640). Индекс реакции (ИР) определяли для каждой мыши по формуле ИР=(Ро-Рк)/Рк и выражали в процентах (Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto Т., et al. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice. Immunol., 1979, V. 38, N.3, p. 577-583).

В качестве контроля использовались здоровые животные соответствующего возраста, которые содержались с экспериментальной группой мышей в аналогичных условиях, но не принимали алкоголь.

После курсового (10 дней) введения мета-хлорбензгидрилмочевины у животных в состоянии хронического алгкоголизма регистрировалось повышение клеточного иммунного ответа, оцененное по выраженности (уровню) развития реакции ГЗТ.

На рисунке 2 представлен уровень развития реакции ГЗТ у мышей (CBA×C57BI/6)F1 в состоянии хронического алкоголизма и после курсового приема мета-хлорбензгидрилмочевины: по оси ординат отображен индекс реакции (%);

1-я группа столбиков (светлые столбики) - контрольная группа здоровых животных; 2-я группа столбиков (темные столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма; 3-я группа столбиков (серые столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма после курсового приема мета-хлорбензгидрилмочевины.

n=15 в каждой группе животных.

р<0,01- между мышами в состоянии хронического алкоголизма и контрольной группой здоровых животных;

р<0,01 между мышами в состоянии хронического алкоголизма до и после мета-хлорбензгидрилмочевины.

Таким образом, сниженный при хроническом алкоголизме клеточный иммунный ответ в результате курсового приема мета-хлорбензгидрилмочевины повышается практически до уровня, характерного для здоровых животных соответствующего возраста.

Оценивая в целом результаты, можно утверждать, что мета-хлорбензгидрилмочевина физиологических дозах, оказывает иммуномодулирующий эффект, определяемый состоянием организма. У интактных (здоровых) особей мета-хлорбензгидрилмочевина повышает спонтанную пролиферативную активность лимфоидных клеток иммунной системы, усиливает действие Т-клеточного митогена и снижает эффект В-клеточного митогена на пролиферацию лимфоцитов. При хроническом алкоголизме мета-хлорбензгидрилмочевина снижает повышенную пролиферативную активность лимфоцитов и повышает их сниженную чувствительность к Т-клеточному митогену, при этом повышается сниженный гуморальный и клеточный иммунный ответ. Указанные показатели изменяются практически до уровня, характерного для здоровых особей, что свидетельствует о восстановлении под действием мета-хлорбензгидрилмочевины функциональной активности иммунной системы и ее клеточных элементов при хроническом алкоголизме.