Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, преимущественно к манипуляциям с прокариотическими, эукариотическими и растительными клетками на микро- и наноуровнях с целью модификации генетического аппарата путем переноса в клетку биологических и синтетических молекул.
Известен способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы, включающий введение генных конструкций шприцем на глубину 2-3 см вблизи зародышевого диска [1].
Этот способ имеет ограниченную производительность и неприменим в микробиологии из-за отсутствия средств контроля точного перемещения шприца.
Известны устройство и способ для переноса молекул в клетки с использованием электрической энергии, включающий использование электрических импульсов, подаваемых на электроды, амплитуду которых рассчитывают в зависимости от расстояния между электродами и от природы тканей таким образом, чтобы создать между электродами электрическое поле, что обеспечивает проникновение активного начала в ткани и в клетки [2].
Недостаток этого способа заключается в сложности процесса введения молекул в клетки.
Известен также способ введения целевых молекул в клетки, включающий закрепление на культуральной подложке в питательной среде рабочих клеток, а также введение целевых молекул в рабочие клетки путем прокола их клеточных мембран последовательно одной иглой [3].
Этот способ выбран в качестве прототипа предложенного решения.
Недостаток этого способа заключается в низкой производительности процесса, связанной с индивидуальной работой одной иглой.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении производительности способа.
Указанный технический результат заключается в том, что в способе введения целевых молекул в клетки, включающем закрепление на культуральной подложке в питательной среде, по меньшей мере, одной рабочей клетки, введение целевых молекул, по меньшей мере, в одну рабочую клетку путем прокола клеточной мембраны, по меньшей мере, одной иглой, на культуральной подложке закрепляют массив рабочих клеток, а целевые молекулы попадают в рабочие клетки через поры, созданные в клеточных мембранах с помощью массива игл.
Существуют варианты, в которых в качестве культуральной подложки используют культуральный пластик, или оптически обработанные стекла, или кремний.
Существуют также варианты, в которых на культуральной подложке формируют монослой прилипающих рабочих клеток, или культуральную подложку модифицируют антителами, на которые закрепляют рабочие клетки, или на культуральную подложку наносят фрагменты связывающего слоя для антител, на которые сначала закрепляют специфические для определенного типа клеток антитела, а потом рабочие клетки.
Существуют также варианты, в которых на культуральной подложке формируют бороздки или лунки, в которые закрепляют рабочие клетки.
Существуют также варианты, в которых на культуральной подложке закрепляют рабочие клетки с использованием внешнего магнитного поля и посредством частиц ферромагнетика, захваченных рабочими клетками, или с помощью антител, закрепленных на ней с использованием внешнего магнитного поля и ферромагнитных частиц, вступивших с антителами в ковалентную связь.
Существуют также варианты, в которых в качестве массива игл используют массив микрошипов или массив микропипеток.
Существует также вариант, в котором глубину проникновения игл в клетки осуществляют с помощью ограничителей высоты.
Существует также вариант, в котором прокол клеток осуществляют при воздействии ультразвука.
Существуют также варианты, в которых попадание целевых молекул в рабочие клетки из питательной среды при использовании микрошипов происходит после извлечения их из рабочих клеток или осуществляется из раствора с целевыми молекулами, находящегося в микропипетках и это происходит во время нахождения их в рабочих клетках.
Существует также вариант, в котором массив игл периодически очищают и стерилизуют.
Существуют также варианты, в которых в качестве массива рабочих клеток используют однокоординатную линейку рабочих клеток, а в качестве массива игл используют однокоординатную линейку игл или в качестве массива рабочих клеток используют двухкоординатную матрицу рабочих клеток, а в качестве массива игл используют двухкоординатную матрицу игл.
Существуют также варианты, в которых количество игл соответствует или больше количества рабочих клеток на культуральной подложке, при этом площадь массива игл равна площади массива игл рабочих клеток.
Существует также вариант, в котором в каждой рабочей клетке делают больше одного прокола.
Существует также вариант, в котором количество игл меньше количества рабочих клеток на культуральной подложке.
На фиг.1 изображена схема прокола массива рабочих клеток массивом игл.
На фиг.2 изображена схема ориентированного по трем координатам (X, Y, Z) прокола массива рабочих клеток массивом игл.
Реализация предложенного способа осуществляется следующим образом.
На культуральной подложке 1 (Фиг.1), расположенной в питательной среде, закрепляют массив рабочих клеток 2. После этого массивом игл 3 осуществляют прокол массива рабочих клеток. Размеры рабочих клеток имеют большой разброс значений, в основном от 200 мкм у яйцеклеток до 20 мкм у соматических клеток. Существуют также рабочие клетки, размеры которых выходят за этот диапазон. Лимфоциты имеют размеры 7-9 мкм, моноциты - 12-20 мкм. Учитывая этот фактор, неплоскостность культуральной подложки (далее «подложки») должна быть достаточно высокой. Используя в качестве подложки культуральный пластик, например полистирол, поликарбонат или поливинилхлорид, размером 10×10 мм, методами механической полировки можно довести неплоскостность его поверхности до величины менее 1 мкм. В этом случае достаточно эффективно использовать рабочие клетки с размерами, превышающими 20 мкм. Если в качестве культуральной подложки использовать оптически обработанное стекло, неплоскостность которого на таких же площадях может составлять величину менее 0.1 мкм, то на нем можно работать с клетками, имеющими размеры менее 20 мкм. Следует заметить, что в качестве материалов культуральных подложек можно использовать и другой материал, нетоксичный для живых клеток, например слюду или кремний. Методы подготовки поверхностей различных материалов и их очистки см. в [4, 5].
Следует заметить, что в качестве культуральной подложки можно использовать дно чашки Петри, если оно будет соответствовать вышеописанным критериям неплоскостности.
Далее культуральную подложку располагают в чашке Петри с питательной средой. Существует несколько вариантов закрепления массивов рабочих клеток на культуральных подложках.
В первом варианте используют прилипающие клетки. Поверхность подложки сначала стерилизуют в автоклаве или сухожаровом шкафу. После этого подложку размещают в чашке Петри, в которую наливают питательную среду с рабочими клетками. В зависимости от типа клеток формируется их монослой на поверхности подложки в течение трех-четырех часов (среднее время прилипания). Существуют также клетки (фибропласты), которые прилипают к поверхности культуральной подложки за 20 мин.
Во втором варианте моноклональные антитела, специфические к определенному типу клеток, иммобилизируют на культуральную подложку (модифицируют подложку антителами). Этот процесс может проходить за счет обработки подложки веществом, обеспечивающим ковалентную связь с антителами. Расстояние между антителами, закрепленными на подложке, определяется плотностью антител в растворе, количеством этого раствора и площадью, на которой формируются антитела. Например, при концентрации антител 0.05 - 0.2 мкг/мл, количестве раствора 50 мкл и размерах подложки 10×10 мм расстояние между антителами будет в диапазоне 10-100 мкм. Возможно два варианта использования подложек, модифицированных антителами. В одном варианте подложку с антителами высушивают при комнатной температуре для последующего их использования, в другом - используют без высушивания. Далее подложку с антителами помещают в чашку Петри и наливают питательную среду с рабочими клетками. При этом рабочие клетки закрепляются на подложке. Рабочие клетки могут быть расположены плотным слоем, а также на некотором расстоянии друг от друга. Это расстояние определяется расстоянием между первично закрепленными на поверхности подложки антителами. Количество рабочих клеток, введенных в чашку Петри, может на 20% превышать количество антител, модифицированных на подложке. Более подробно этот процесс описан в [6].
В третьем варианте на подложку с помощью принтера наносят фрагменты связывающего слоя с шагом, например, в два раза превышающим размеры рабочих клеток. Работу принтера см. в [7]. Далее из раствора антител на этих фрагментах иммобилизируют (закрепляют) антитела, а потом, как и в предыдущем пункте, на антителах закрепляют рабочие клетки.
В четвертом варианте на культуральной, например кремниевой, подложке 4 (Фиг. 2) формируют бороздки 5, имеющие, например, прямоугольную или треугольную формы. Эти бороздки могут быть сформированы традиционными фотолитографическими методами [4, 5]. Ширина бороздок А должна соответствовать размерам клеток, а глубина В составлять не менее 40% этих размеров. Расстояние между бороздками должно быть порядка размера клеток. Далее на дне бороздок 5 с помощью принтера [7] формируют фрагменты связывающего слоя 6 для антител, на которых закрепляют антитела 7 и далее рабочие клетки 8. Связывающий слой 6 может покрывать все дно бороздок 5 по координате Y, тогда антитела 7 и рабочие клетки 8 будут расположены в бороздках 5 плотно друг к другу.
В пятом варианте на подложке 4 методами фотолитографии формируют лунки 5 [4, 5], размеры которых А в плоскости подложки 4 соответствуют размерам рабочих клеток 8, а глубина В составляет не менее 40% этих размеров. В этих лунках аналогичным образом формируется связывающий слой 6, на котором закрепляются антитела 7 и далее рабочие клетки 8. (Условно четвертый и пятый варианты рассмотрены на одной Фиг. 2, т.к. бороздки в сечении изображаются так же, как и лунки.)
В шестом варианте в чашку Петри, содержащую питательную среду с рабочими клетками, вводят наночастицы ферромагнетика, например оксида железа, с размерами частиц порядка 20 нм. Рабочие клетки захватывают эти частицы. В среднем необходимо 20 частиц на одну рабочую клетку. Под дном чашки Петри располагают плоский магнит с индукцией порядка 2 Тл. В результате этого рабочие клетки, содержащие частицы ферромагнетика, закрепляются на поверхности культуральной подложки, например, в виде монослоя. Использование ферромагнитных частиц для закрепления рабочих клеток целесообразно в том случае, если клетки неспособны к прилипанию, но способны к захвату частиц ферромагнетика.
В седьмом варианте в раствор с антителами, находящийся, например, в пробирке, вводят наночастицы ферромагнетика, покрытые слоем, обеспечивающим ковалентную связь со специфическими к определенному типу клеток антителами. Далее раствор с антителами с прикрепленными частицами ферромагнетика наносят на культуральную подложку, расположенную в чашке Петри, слоем толщиной порядка 1 мм. Под дном чашки Петри располагают магнит с индукцией порядка 2 Тл. Антитела закрепляются на культуральной подложке. Плотность расположения антител на подложке определяется их концентрацией в растворе и количеством раствора на определенной площади подложки. После этого в чашку Петри наливают питательную среду с рабочими клетками, которые связываются с антителами и таким образом закрепляются на культуральной подложке. Следует заметить, что при использовании лунок в подложке в отдельных случаях, если размеры лунок составляют величину порядка 100 мкм, регулируя величину магнитного поля, можно добиться того, что антитела с закрепленными на них частицами ферромагнетика магнитными силами и соответственно клетки закрепляются в лунках.
После того как на культуральной подложке закрепили массив рабочих клеток, осуществляют прокол их мембран массивом игл для проникновения в образовавшиеся отверстия (поры) целевых молекул. Это может происходить следующим образом.
В первом варианте массив игл выполнен в виде массива микрошипов 9 (Фиг. 2), изготовленных, например, на кремниевом модуле 10. Этот модуль закрепляют на держателе (не показан) и, используя, например, ограничители высоты, осуществляют прокол рабочих клеток 8 (например, в ручном режиме). В качестве ограничителей высоты можно использовать выступы 11, расположенные по периферии культуральной подложки 4, или выступы, расположенные на кремниевом модуле вне зоны массива микрошипов (не показано). Имея одну высоту С, выступы 11 обеспечивают параллельность кремниевого модуля 10 и подложки 4. Выступы на культуральной подложке 4 и кремниевом модуле 10 могут быть сформированы методами фотолитографии. Для того чтобы исключить влияние расплющенных выступами клеток на глубину прокола при суммарной площади выступов порядка 2×2 мм усилие, с которым кремниевый модуль прижимается к подложке, должно быть порядка 20 Г. В качестве массива микрошипов можно использовать стандартные кремниевые модули [8] размером 5×5 мм, где микрошипы занимают площадь 2×2 мм. Могут использоваться и специально изготовленные модули с микрошипами. Высота D микрошипов может составлять величину 2-10 мкм с углами при вершине 8-45 град., а расстояние между ними может быть, например, 20-400 мкм в зависимости от расстояния между рабочими клетками. Следует заметить, что если имеются массивы игл с определенными расстояниями, то рабочие клетки нужно располагать на культуральной подложке в соответствии с этими расстояниями. Толщина С ограничителей высоты 11 должна быть примерно на 2 мкм меньше суммарной высоты игл D и клеток Е, выступающей над поверхностью подложки 4. При этом будет осуществляться гарантированный прокол клеточных мембран примерно на глубину 1.5-2 мкм с учетом деформации клеток. Следует заметить, что глубину прокола для каждого типа клеток можно подбирать индивидуально, исходя из размера пор, которые должны составлять единицы микрон. Использование выступов 11 - это один из вариантов регулировки глубины проколов в клетках 8. В других вариантах можно использовать точные, например интерферометрические, датчики линейного перемещения кремниевого модуля 10. После прокола мембран шипы 9 извлекаются из клеток 8, а целевые молекулы через поры проникают внутрь клеток 8.
Во втором варианте прокол рабочих клеток осуществляют массивом микропипеток, а введение целевых молекул производят подачей их в растворе из резервуара через микропипетки. Микропипетки могут быть изготовлены по технологии, подробно описанной в [9, 10, 11]. В этом случае также должны использоваться ограничители высоты - выступы. Количество раствора, проникающего внутрь каждой рабочей клетки, может быть в пределах 2-10% от ее объема. Зная количество рабочих клеток и микропипеток можно рассчитать суммарный объем раствора с целевыми молекулами, который необходимо ввести в рабочие клетки. Это может быть решено путем введения в систему подачи раствора поршня с диаметром малого размера, менее 1×1 мм. Величину перемещения поршня легко перевести в объем раствора, введенного в массив клеток. Подробно технологию введения раствора с целевыми молекулами в клетки см. в [12].
Процесс прокола клеток может сопровождаться подачей ультразвука в зону прокола. Это может быть осуществлено с использованием ультразвукового устройства [13].
Примерно после каждых десяти проколов модуль с иглами целесообразно очищать и стерилизовать. Очистка необходима для удаления остатков клеточного детриса, который может препятствовать прокалыванию клеточных мембран и попадать внутрь клеток. А стерилизация необходима для предотвращения инфицирования питательной среды. Следует заметить, что оптимальное число проколов до стерилизации в каждом конкретном случае определяется эмпирически. Очистку игл можно проводить в проточной дистиллированной воде в течение 5-ти минут с последующей сушкой при комнатной температуре. После этого можно провести стерилизацию в автоклаве - 45 минут при температуре 120°С и давлении 1.2 атм либо в сухожаровом шкафу около 2-х часов при температуре 140-160°С.
Возможны варианты, в которых в качестве массива рабочих клеток используют однокоординатную линейку рабочих клеток, а в качестве массива игл используют однокоординатную линейку игл или в качестве массива рабочих клеток используют двухкоординатную матрицу рабочих клеток, а в качестве массива игл используют двухкоординатную матрицу игл. Однокоординатная линейка рабочих клеток может быть сформирована в одной бороздке или в лунках, расположенных по одной линии.
В том случае, если количество игл 9 (Фиг. 2) равняется количеству рабочих клеток 8, упорядоченно закрепленных в бороздках или лунках 5 посредством связывающего слоя 6 и антител 7, то можно ориентированно
каждой иглой прокалывать каждую клетку. При этом площадь массива игл может равняться площади массива рабочих клеток. Для этого необходимо сориентировать кремниевый модуль 10 относительно ориентиров на культуральной подложке 4. Это может быть осуществлено, например, с помощью дополнительных бороздок или лунок 12 (реперных знаков), расположенных на расстоянии, равном длине стороны квадратного кремниевого модуля 10 (например, четыре бороздки вдоль каждой стороны модуля 10). Реперные знаки 12 могут быть одного размера с основными, если размеры рабочих клеток 8 составляют величину 100-200 мкм. Если бороздки или лунки 5 для рабочих клеток 8 имеют размеры порядка 10 мкм, то такие же бороздки или лунки в качестве реперных использовать затруднительно и реперные знаки 12 необходимо делать в том же процессе фотолитографии, что и основные, но большего размера. Наблюдая в оптический микроскоп симметричное расположение кремниевого модуля 10 с иглами 9, а более точно его краев 13 относительно реперных знаков 12, можно сориентировать модуль 10 по координатам X, Y относительно рабочих клеток 8. В этом случае модуль 10 с иглами 9 можно располагать на трехкоординатном (X, Y, Z) микроманипуляторе [14] (не показан).
Существует вариант, в котором количество игл на модуле заведомо превышает количество рабочих клеток на подложке (при тех же площадях). В этом случае в каждой клетке можно формировать более одной поры.
Также используется вариант, в котором количество игл на модуле меньше количества рабочих клеток на культуральной подложке при равном расстоянии между клетками и иглами. В этом случае прокол мембран может осуществляться пошагово последовательно на всем поле подложки с рабочими клетками. Модуль с иглами должен располагаться на микроманипуляторе (см., например, [14]), а совмещение будет происходить по реперным лункам, расположенным на всей площади с рабочими клетками.
После того как целевые молекулы введены в рабочие клетки, дальнейшие действия с ними могут происходить в той же чашке Петри без съема их с подложки, например, для экспрессии рекомбинантных белков, для производства белков человека в дрожжевых или растительных рабочих клетках.
В другом варианте рабочие клетки с целевыми молекулами снимают с культуральной подложки. После этого рабочие клетки переносят в другую культуральную посуду для разращивания с целью получения белков, а также использования этих клеток в регенеративной и заместительной клеточной терапии.
Для определения эффективности указанного способа введения целевых молекул в клетки в качестве рабочих клеток была использована клеточная линия эпидермоидной карциномы гортани человека НЕР-2 (размер клеток 8-15 мкм), обладающая потенциалом спонтанного прилипания к пластику.
Целью эксперимента было определить эффективность способа введения целевых молекул в клетки и влияние используемого способа, в частности процедуры прокола мембран клеток с помощью массива игл, на жизнеспособность (выживаемость) клеток.
Материалы и методы: в качестве культуральной подложки использовалось дно пластиковых чашек Петри диаметром 3 см (JET BIOFIL, Китай). Рабочие клетки НЕР-2 культивировали в полной питательной среде DMEM до формирования монослоя. Жизнеспособность рабочих клеток определяли методом исключения красителя эритрозина. В качестве целевой молекулы использовали плазмиду pCI-neo-GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в растворе питательной среды, что позволяет оценивать эффективность способа введения целевых молекул в рабочие клетки на флуоресцентном микроскопе. Формирование пор в мембранах рабочих клеток осуществляли путем прокола клеточной мембраны с помощью массива игл в ручном режиме.
Технические характеристики двухкоординатной матрицы массива игл: размер матрицы - 8000×8000 мкм; расстояние между иглами в массиве - 20 мкм (т.е. в данном эксперименте количество игл в массиве меньше количества рабочих клеток, расположенных на культуральной подложке); высота игл - 3,0 мкм. Для обеспечения параллельного подвода матрицы с массивом игл к подложке, сохранности клеток и контроля глубины проникновения иглы в клетку сформированы ограничители высоты, расположенные по периферии матрицы массива игл, толщиной 5 мкм. Ограничители высоты позволяют осуществлять прокол клеточных мембран на глубину 1,5-2,0 мкм с учетом деформации клеток.
В качестве контроля предложенного способа введения целевых молекул в рабочие клетки для оценки жизнеспособности рабочих клеток и эффективности способа использовали наиболее часто используемый на сегодня способ химического переноса целевых молекул в рабочие клетки с помощью стандартного набора растворов CytofecteneTM Transfection Reagent Kit (BIO-RAD, США) согласно инструкции производителя.
Описание эксперимента: После формирования монослоя массивом рабочих клеток НЕР-2 на культуральной подложке (пластике чашек Петри) в питательную среду добавляли целевые молекулы (плазмида pCI-neo-GFP в количестве 10 мкг на чашку). Далее осуществляли прокол мембран рабочих клеток с помощью матрицы с массивом игл в ручном режиме. Предварительно для предотвращения инфицирования питательной среды с рабочими клетками матрицы с массивами игл стерилизовали в сухожаровом шкафу в течение 2 часов при температуре 160°С.
После осуществления проколов рабочие клетки оставляли на культуральной подложке в питательной среде еще в течение 1,5 часов для проникновения целевых молекул из раствора в рабочие клетки через поры, созданные с помощью массива игл. Оценку эффективности способа введения целевых молекул в рабочие клетки осуществляли через 24 часа по включению в рабочие клетки целевых молекул зеленого флуоресцирующего белка pCI-neo-GFP с помощью флуоресцентного микроскопа Axioskop 40 (С. Zeiss).
Результаты: Жизнеспособность рабочих клеток НЕР-2 в эксперименте по предложенному способу введения целевых молекул в клетки составила в среднем 94-100%, в способе переноса целевых молекул в клетки химическим способом с использованием CytofecteneTM Transfection Reagent Kit в среднем жизнеспособность рабочих клеток составила 56-71%. Эффективность способа введения целевых молекул в рабочие клетки НЕР-2 в эксперименте по предложенному способу, оцененная по включению рабочими клетками целевых молекул pCI-neo-GFP, составила в среднем величину 82-91%, при этом в способе переноса целевых молекул в клетки с использованием набора растворов CytofecteneTM Transfection Reagent Kit эффективность аналогичного показателя была значительно ниже и была определена на уровне 28% от общего числа клеток.
Отличительные признаки, заключающиеся в том, что на культуральной подложке закрепляют массив рабочих клеток, а целевые молекулы попадают в рабочие клетки через поры, созданные в клеточных мембранах с помощью массива игл, увеличивает производительность способа. Когда используется массив игл, нет необходимости проводить совмещение каждой иглы с каждой клеткой и производительность способа увеличивается также и по этой причине. При этом процесс упрощается за счет минимизации ручного труда при совмещении игл с клетками и повышается его надежность за счет уменьшения вероятности ошибок совмещения. Кроме этого индивидуальное совмещение иглы с клеткой возможно только при использовании клеток, имеющих размеры более 10 мкм. В предложенном решении размер клеток в сторону уменьшения может быть практически любым. Таким образом, предложенный способ имеет расширенные функциональные возможности по сравнению с известными.
Отличительные признаки, заключающиеся в том, что на культуральной подложке формируют монослой прилипающих рабочих клеток, или культуральную подложку модифицируют антителами, на которые закрепляют рабочие клетки, или на культуральную подложку наносят фрагменты связывающего слоя для антител, на которые сначала закрепляют антитела, а потом рабочие клетки, а также что используют бороздки и лунки, в которых закрепляют рабочие клетки, а также что используют магнитное поля для закрепления рабочих клеток, повышают надежность закрепления рабочих клеток и соответственно производительность способа.
Использование микрошипов и микропипеток расширяет функциональные возможности способа и его производительность за счет выбора для каждого типа клеток своего режима.
Использование ограничителей высоты повышает вероятность гарантированного прокола каждой клетки при их сохранности и соответственно производительность способа в целом.
Использование ультразвука при проколах мембран уменьшает деформацию рабочих клеток при проколах, их сохранность и производительность способа.
Использование очистки и стерилизации игл повышает производительность способа за счет большего числа жизнеспособных рабочих клеток, в которые внедрены целевые молекулы.
Различные варианты использования соотношений количества игл и рабочих клеток также направлены на увеличение производительности способа.
Литература
1. Патент RU 2303068. 20.07.2007.
2. Заявка RU 2007102568. 27.07.2008.
3. Markus Montag. Preimplantation genetic diagnosis: Polar body biopsy. Note 140. March 2007.
4. Мазель Е.З. Планарная технология кремниевых приборов. М.: Энергия. 1974. 384 с.
5. Степаненко И.П. Основы микроэлектроники. М.: Советское радио. 1980. 423 с.
6. Патент RU 2267787. 20.01.2005.
7. www.blek-medical.ru (Биочипы - настоящее и будущее).
8. Заявка US2006027525. 09.02.2006.
9. Заявка KR20070059916. 12.06.2007.
10. www.nascatec.com
11. www.ntmdt.ru
12. Herald Andrulat and Sonja Voss. Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI). - Procedure and Equipment. Note 009. June 2006.
13. www.elpapiezo. ru
14. www.dinamotimal.ru