Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ УСНИНОВОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ СИНЕРГИСТА ИНСЕКТИЦИДОВ НА ОСНОВЕ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к сельскому и лесному хозяйству и может быть использовано для повышения биологической эффективности инсектицидных препаратов на основе энтомопатогенных микроорганизмов.

С 60-70 гг. прошлого века активно разрабатывалась технология повышения эффективности инсектицидных биопрепаратов использованием смесей биопрепаратов с химическими инсектицидами. Было установлено, что добавление пониженных доз химических инсектицидов к биопрепаратам резко повышает их эффективность [Теленга Н.А., Сикура А.И., Тронь Н.М. Последействие гриба белой мускардины Beauveria bassiana при заражении личинок колорадского жука // ДАН СССР, 1966, т.169, №5, с.256-260; Бенц Г. Синергизм микроорганизмов и химических инсектицидов М.: Колос, 1976, с.260-295; Цибульска А.И. Применение рижского штамма гриба белой мускардины в борьбе с колорадским жуком // Патология насекомых: Сб. статей. Рига, Зинатне, 1972, с.5-35; Свикле М.Я. Использование биопрепарата боверин совместно с пониженными дозами хлорофоса, полихлоринена в борьбе с колорадским жуком // Бюл. ВИЗР, 1971, №18, с.41-42; Король И.Т., Сокольчик А.П. Способы повышения эффективности биопрепаратов в борьбе с вредными насекомыми, Минск: БелНИИНТИ, 1982, 28 с.]

Описаны синергетические смеси для повышения смертности насекомых, в которых одновременно используются энтомопатогены и химические инсектициды.

Так, энтомопатогенные грибы Beauveria bassiana и имидаклоприд в сублетальных дозах изучались в лабораторных условиях на Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae) [Pest management science, 61 (4), p.363-370, Apr 2005]. Показано, что потенциальным средством для борьбы с вредителями является именно смесь гриба В.bassiana и имидаклоприда.

К недостаткам указанной смеси относится присутствие в ней имидаклоприда, являющегося токсичным синтетическим веществом [Pesticides News, No. 62, December 2003, pp.22-23; http://www.pan-uk.org/pestnews/Actives/imidaclo.htm].

Имидаклоприд (никотиноидный пестицид) - относительно новый системный инсектицид. Он работает, блокируя элементы нервной система насекомого, которые более восприимчивы к токсическому влиянию имидаклоприда, чем таковые у теплокровных животных.

Имидаклоприд производится фирмой Bayer CropScience. Начиная с его запуска в производство в 1991 г., препараты, содержащие имидаклоприд, получили регистрацию приблизительно в 120 странах и продаются в огромных количествах для использования на более чем 140 сельскохозяйственных культурах. В связи с этим накоплен большой массив данных о токсичности имидаклоприда.

ВОЗ рассматривает имидаклоприд как умеренный яд. Его кратковременное воздействие (острая токсичность) на теплокровных вызывает недостаток координации, тремор, диарею и потерю веса, при хроническом воздействии особенно страдает щитовидная железа. Препарат обладает мутагенными свойствами, влияет на репродуктивную функцию (увеличивает количество самопроизвольных абортов и увеличение количества потомства с нарушениями скелета). Острое отравление птиц имидаклопридом вызывает у них неспособность летать, нарушения в координации и продолжении рода, широко варьируясь для разных птиц своими последствиями. Препарат ядовит для рыб, особенно для молодых особей, и пресноводных ракообразных, высокотоксичен для медоносных пчел, земляных червей и божьих коровок. Препарат загрязняет своим присутствием овощные культуры, обрабатывавшиеся им, попадает в грунтовые воды, а затем и в реки.

К тому же, являясь остро и хронически ядовитым по отношению к человеку и полезным животным, загрязняя окружающую среду, он становится безопасным по отношению к вредителям, выработавшим к нему резистентность.

Описано [US4668511] использование смеси бакуловирусов совок (Spodoptera littoralis или Mamestra brassicae) и светостабильного пиретроида для борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями. В качестве светостабильного пиретроида используется дельтаметрин. Опыты на хлопковой плантации, произведенные смесью бакуловируса Mamestra brassicae с дельтаметрином, позволили выявить синергизм этой смеси, принимая в качестве критерия выход хлопковых семян. Действительно, смесь дозы дельтаметрина, равная 1/10 нормальной дозы, которая обычно рекомендуется (25 г активного вещества на 1 га) и прививки бакуловируса Mamestra brassicae в 1×10¹³ полиэдров на 1 га, обеспечила значительное увеличение выхода хлопковых семян по отношению к тем же инсектицидам, употребляемым отдельно в тех же дозах. Показано, что предпочтительные дозы пиретроида соответствуют разбавлениям от 1/5 до 1/100 нормальной дозы, обычно применяемой для данного соединения (с учетом лабораторных или полевых испытаний). Для бакуловирусов, употребляемых в смеси с дельтаметрином, летальные дозы соответствуют приблизительно значениям между 1/5 и 1/10 употребляемой нормальной дозы. Таким образом, возможно употребление бакуловирусов в количествах меньше или равных обычно рекомендуемым (1×10¹³ полиэдров на 1 га). Применение указанной смеси возможно не только на хлопчатнике, но и на сое, рисе, маисе, свекле, табаке, огородных культурах (томаты, капуста, бобы), на кормовых травах (люцерна, клевер), на винограде, цитрусовых, кофейном, тутовом и чайном деревьях, бананах.

К недостаткам этой смеси относится токсичность дельтаметрина [http://extoxnet.orst.edu/pips/deltamet.htm].

Дельтаметрин относится к пиретроидам второго поколения - синтетическим аналогам природных пиретринов, он является инсектицидом широкого спектра действия, используется на хлопке, пшенице, кукурузе, люцерне и других зерновых культурах. Дельтаметрин, подобно всем синтетическим пиретроидам, является нейротоксином.

Острое отравление людей дельтаметрином приводит к таким последствиям, как атаксия, судороги, паралич, дерматит, отек, одышка, головная боль, раздражительность, периферический васкулярный коллапс, ринорея, звон в ушах, тремор, диарея, рвота и смерть от удушья. Аллергические реакции проявляются в виде анафилаксии, бронхоспазма, эозинофилии, лихорадки, гиперсенситивной пневмонии, бледности, поллиноза, усиленного потоотделения, внезапного отека лица, век, губ и слизистых оболочек, тахикардии. Зафиксировано много случаев кожного отравляющего воздействия дельтаметрина при использовании в сельском хозяйстве в отсутствие адекватных мер предосторожности и множество фактов случайного или суицидального отравления при приеме внутрь доз 2-250 мг/кг. Оральное попадание дельтаметрина в организм вызывает эпигастральную боль, тошноту и рвоту. Дозы 100-250 мг/кг способны вызвать кому за 15-20 минут.

Дельтаметрин токсичен для рыб и зоопланктона, что увеличивает зарастание водоемов водорослями, а также для медоносных пчел и других полезных насекомых.

Таким образом, присутствие в синергетической смеси токсичных синтетических химических инсектицидов приводит к утрачиванию селективности биопрепаратов, а следовательно, к вредным последствиям для человека, полезных животных и всей окружающей среды. К тому же использование химических инсектицидов в пониженных дозировках может приводить к ускоренному формированию резистентности насекомых к инсектицидам [Харсун А.И. Биохимия насекомых. Кишенев: Картя Молдавенска, 1976. 270 с.].

Задачей изобретения является новый безопасный и эффективный синергист инсектицидов на основе энтомопатогенных микроорганизмов.

Поставленная задача решается применением усниновой кислоты формулы I

в качестве синергиста инсектицидов на основе энтомопатогенных микроорганизмов.

Начиная со своего первого выделения в 1844 г., усниновая кислота (2,6-диацетил-7,9-дигирокси-8,9b-диметил-1,3(2Н, 9bН)-дибензо-фурандион) стала наиболее широко изучаемым метаболитом лишайника и одним из немногих коммерчески доступных. Усниновая кислота содержится в лишайниках, и особенно много ее в лишайниках родов Alectoria, Cladonia, Usnea, Lecanora, Ramalina и Evernia. Многие лишайники и экстракты, содержащие усниновую кислоту, использовались в фармацевтике, парфюмерии, косметике и экологии. Усниновая кислота в виде чистой субстанции использовалась в кремах, зубной пасте, жидкости для полоскания рта, дезодорантах и солнцезащитных средствах, в некоторых случаях как действующее вещество, в других как консервант. В дополнение к антимикробной активности по отношению к патогенам человека и растений усниновая кислота проявила противовирусную, антипротозойную, антипролиферативную, противовоспалительную активность, а также болеутоляющее действие. В экологии усниновая кислота проявила себя как ингибитор роста, гербицид и инсектицид [Usnic acid, К. Ingolfsdottir, Phytochemistry, 61 (2002), 7, 729-736].

Синергетические свойства усниновой кислоты изучались на гусеницах пчелиной огневки (Galleria mellonella) лабораторной популяции, личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), собранных на растениях картофеля в республике Татарстан, и гусеницах непарного шелкопряда (Limantria dispar), собранных в Новосибирской области. Для работы использовали гусениц V возраста пчелиной огневки, личинки II-го возраста колорадского жука и гусениц II-го возраста непарного шелкопряда. Для инфицирования насекомых использовали штаммы энтомопатогенных микроорганизмов из коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН. Инфицирование насекомых энтомопатогенными грибами проводили контактным способом, путем опрыскивания суспензией конидий, инфицирования бактериями и вирусами - пероральным способом, путем нанесения суспензии спор бактерий и вирионов на корм насекомых.

Для оценки влияния усниновой кислоты на развитие инфекционных заболеваний проводили совместную обработку насекомых энтомопатогенными микроорганизмами и усниновой кислотой. Для этого усниновую кислоту растворяли в ацетоне, затем ацетоновые растворы с различной концентрацией усниновой кислоты добавляли к суспензии конидий грибов, спор бактерий и вирионов, полученную смесь использовали для инфицирования насекомых. В контрольных вариантах использовали обработку насекомых физиологическим раствором с добавлением эквивалентных количеств ацетона, а также обработку насекомых по отдельности энтомопатогенными микроорганизмами и усниновой кислотой, суспензированными в ацетоне. Результаты таких экспериментов содержатся в первой строчке каждой таблицы.

Обработку проводили однократно, в лаборатории - путем кратковременного (1-2 сек) окунания насекомых в водную суспензию конидий энтомопатогенных грибов, в полевых условиях - методом опрыскивания растений водной суспензией конидий энтомопатогенных грибов. В воду предварительно добавляли усниновую кислоту, растворенную в ацетоне (методы инфицирования описаны выше).

Эффективность использования усниновой кислоты в качестве синергиста для биопрепаратов на основе энтомопатогенных микроорганизмов может быть продемонстрирована примерами, приведенными ниже.

Пример 1. В лабораторных условиях было изучено влияние усниновой кислоты на развитие грибных инфекций у насекомых при экспериментальном их инфицировании. В качестве тест-объектов использовали личинок колорадского жука, гусениц пчелиной огневки и непарного шелкопряда. Личинок колорадского жука собирали в природных условиях (пос.Кольцове Новосибирской обл.). В лаборатории их содержали в стеклянных 3-литровых банках при комнатной температуре и естественном освещении. В качестве корма использовали листья и стебли картофеля. Гусениц непарного шелкопряда выводили из яйцекладок, собранных в природных условиях (Татарский район Новосибирской области). Яйцекладки хранили в холодильнике при +3-4°С. Для получения гусениц их помешали в чашки Петри и оставляли на несколько дней при комнатной температуре (+18-20°С). Гусениц содержали в аналогичных условиях, что и личинок колорадского жука. В качестве корма использовали листья березы. Гусениц пчелиной огневки разводили в лабораторных условиях: без освещения, при температуре 31±1°С, корм - искусственная среда Вейзера.

Для инфицирования насекомых использовали коллекционные штамма грибов Metarhizium anisopliae и Beauveria bassiana (в форме конидий). Инфицирование насекомых грибами проводили контактным методом путем кратковременного, на 1-2 сек, погружения в суспензию конидий с титром 1,5±0,5×10⁶ в 1 мл. Данная концентрация обеспечивала гибель насекомых на уровне 10-30%. Для оценки влияния усниновой кислоты на развитие инфекционных заболеваний проводили совместную обработку насекомых энтомопатогенными грибами и усниновой кислотой. Для этого усниновую кислоту растворяли в ацетоне, затем ацетоновый раствор в различных количествах добавляли к суспензии конидий грибов, полученную смесь использовали для инфицирования насекомых. В контрольных вариантах использовали обработку насекомых физиологическим раствором, в который было добавлено эквивалентное количество ацетона. В эксперименте также были заложены варианты, в которых насекомые были обработаны усниновой кислотой отдельно от энтомопатогенных микроорганизмов. При этом усниновая кислота была использована в сублетальных концентрациях: для обработки гусениц пчелиной огневки и непарного шелкопряда - 0,01%, для личинок колорадского жука - 0,005%.

Повторность эксперимента 4-кратная, количество насекомых на повторность 20-30 шт. на повторность.

В результате экспериментов было установлено, что усниновая кислота обладает свойством существенно увеличивать гибель насекомых при инфицировании их энтомопатогенными микроорганизмами (Табл.1).

Пример 2. В полевом мелкоделяночном опыте проведено изучение эффективности препаратов на основе энтомопатогенных грибов и бактерий против личинок колорадского жука и влияние на их эффективность усниновой кислоты. В работе были использованы следующие коммерческие препараты: Боверин, СУХ П, Г (основа - конидии гриба B.bassiana, не менее 2 млрд. спор на 1 г препарата, изготовитель - НВЦ «Биодрон») и Битоксибацилин, СП (основа - споровокристаллическая масса бактерии B.thuringiensis, биологическая активность не менее 1500 ЕА на 1 мг препарата, изготовитель - ПО «Сиббиофарм»).

Опыты проводили в Искитимском районе Новосибирской области в 2005 г. Опыт был заложен на частных посадках картофеля. Размер делянок - 50 м². Обработку растений проводили вечером в безветренную погоду с помощью ручного опрыскивателя Квазар. Расход рабочей жидкости составлял около 2 л на одну делянку, концентрация конидий грибов и усниновой кислоты в рабочем растворе - 3×10⁷ конидий в 1 мл и 0,005% соответственно. В контроле обработку растений не проводили. В эксперименте также был заложен опыт по применению усниновой кислоты отдельно от энтомопатогенных грибов для оценки ее инсектицидных свойств.

Пример 3. Испытания совместного действия экспериментального препарата Вирин НШ (на основе вируса ядерного полиэдроза) [Бахвалов С.А., Мартемьянов В.В., Подвайт Дж.Д. Сравнительная характеристика биологической активности вирусных препаратов Вирин-НШ и Джипчек (Gypchek) // Евраз. энтомол. журн. -2005. - Т.4. - С.183-186] и усниновой кислоты проводили на гусеницах непарного шелкопряда Lymantria dispar L. в Купинском районе Новосибирской области в 2004 г. Для испытаний отбирались 3 березовых насаждения площадью около 10 га каждый, средний возраст которых составлял 30-35 лет. Средняя численность насекомых составляет около 2000 насекомых на дерево. Обработку проводили: усниновой кислотой в концентрации 0,01%, вирусом ядерного полиэдроза в концентрации 10⁷ полиэдров/мл и совместно вирусом и усниновой кислотой при тех же концентрациях. Раствор усниновой кислоты и суспензия вируса вносились в крону деревьев с помощью моторизированного ранцевого генератора SHTIL. Учет смертности гусениц проводили на 14 сутки после обработки. Для учета насекомых использовали метод спуска кроны.

Испытания совместного действия коммерческого препарата Вирин-диприон (на основе вируса ядерного полиэдроза) [Бахвалов С.А., Жимерикин В.Н., Мартемьянов В.В. Экологическая плотность и чувствительность к вирусной инфекции рыжего соснового пилильщика (Neodiprion sertifer Geoffr.) в сосновых насаждениях с неоднородными лесорастительными условиями // Евраз. энтомол. журн. - 2003. - Т.2. - С.261-264] и усниновой кислоты проводились на личинках рыжего соснового пилильщика Neodiprion sertifer Geoffr в искусственных лесопосадках сосны Волгоградской области в 2003 г. Для эксперимента использовали восьмилетние насаждения. Использовали 3 делянки площадью 3 га каждая. Плотность личинок в среднем составляла около 10 гнезд на одно дерево (600 личинок). Обработки проводили, как описано выше в примере 3. Учет погибших насекомых проводили на 8 сутки после обработки. Для учета насекомых использовали метод спуска кроны.

В результате работы было установлено, что усниновая кислота обладает свойством существенно увеличивать гибель насекомых при инфицировании их энтомопатогенными микроорганизмами. При этом усниновая кислота обладала слабыми инсектицидными свойствами по отношению к личинкам колорадского жука (см. Табл.1). Дозы усниновой кислоты подбирали в зависимости от чувствительности насекомых, то есть в эксперименте были использованы сублетальные дозы. В экспериментах с пчелиной огневкой использовали наиболее высокие дозы, поскольку кутикула гусениц данного вида насекомого характеризуется невысокой проницаемостью.

Гибель насекомых начиналась на вторые-третьи сутки после обработки и заканчивалась на шестые-седьмые сутки. В таблицах представлена суммарная гибель насекомых, зафиксированная в лабораторных экспериментах. В третьем столбце каждой таблицы указан процент смертности насекомых, полученный при обработке только энтомопатогенными препаратами; в четвертом столбце указаны проценты гибели насекомых при одновременной обработке энтомопатогенными препаратами и усниновой кислотой. Следует отметить значительный рост гибели насекомых при добавлении усниновой кислоты ко всем энтомопатогенным препаратам и на всех типах насекомых.

Таким образом, при применении усниновой кислоты в качестве синергиста инсектицидов на основе энтомопатогенных микроорганизмов:

- увеличивается процент гибели гусениц пчелиной огневки по сравнению с обычным инфицированием энтомопатогенными грибами и бактериями;

- увеличивается процент гибели личинок колорадского жука по сравнению с обычным инфицированием энтомопатогенными грибами и бактериями;

- увеличивается процент гибели гусениц непарного шелкопряда по сравнению с обычным инфицированием энтомопатогенными грибами, бактериями и вирусами.

Преимущества использования усниновой кислоты в качестве синергиста инсектицидов на основе энтомопатогенных микроорганизмов в том, что усниновая кислота - вещество природного происхождения, а потому более безвредное для человека, полезных животных и всей окружающей среды.