Способ определения содержания салициловой кислоты в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза

Изобретение относится к аналитической химии фенолкарбоновых кислот, в частности к способу определения салициловой кислоты.

Салициловая кислота - эндогенный регулятор роста. Она регулирует защитную реакцию растительного организма на действие стресс-факторов биотической и абиотической природы. Салициловая кислота вызывает внутриклеточные изменения антиоксидантной системы в растительном организме, оказывая влияние на антиоксидантные ферменты, влияет на генерацию активных форм кислорода. Салициловая кислота выполняет функции сигнальной молекулы, активирующей ферменты синтеза защитных соединений широкого спектра действия (антимикробная, фунгицидная, антивирусная). Под действием инфекции, УФ-излучения и озона содержание салициловой кислоты в растениях увеличивается (Г.-В. Хелдт Биохимия растений. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 471 с.).

Салициловая кислота (2-гидроксибензойная или фенольная кислота) С₆Н₄(ОН)СООН представляет собой бесцветные кристаллы, хорошо растворима в диэтиловом эфире, этаноле, бензоле и других менее полярных органических растворителях, плохо растворима в воде (1,8 г/л при 20 С). При нагревании салициловая кислота декарбоксилируется до фенола.

Соли щелочных металлов (Na, K) салициловой кислоты хорошо растворимы в воде, но не растворимы в неполярных растворителях. Карбоновая кислота извлекается из воды эфиром, в котором она лучше растворяется, легко отмывается разбавленным водным раствором основания. Так при воздействии гидрокарбоната натрия, обладающего слабыми щелочными свойствами на салициловую кислоту образуется салицилат натрия, который хорошо растворим в воде (Р. Моррисон, Р Бойд Органическая химия.-М.: Мир, 1974. - 1132 с.).

Известно, что для количественного определения салициловой кислоты используют различные методы, основанные на получении окрашенных соединений (фотометрический анализ). Так, например, салициловая кислота при взаимодействии с хлористым железом дает фиолетовое окрашивание. При титровании спиртового раствора салициловой кислоты гидроксидом натрия в присутствии фенолфталеина появляется слаборозовое окрашивание от избытка щелочного раствора (Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений, Химия, 1975, с. 272).

Наиболее близким к заявляемому способу техническим решением является способ определения салициловой кислоты в технологических и очищенных сточных водах предприятий химической и парфюмерной промышленности.

Известно, что для выделения салициловой кислоты в присутствии этилсалицилата используют экстракцию его из анализируемых образцов технологических и очищенных сточных вод предприятий химической и парфюмерной промышленности органическим растворителем (октан +х лороформ). При этом салициловая кислота остается в водном растворе (А.с. СССР №1550420 от 15.03.90. Бюл. №10).

Недостаток способа - плохая растворимость салициловой кислоты в воде, совместная экстракция водорастворимых соединений, сложная методика очистки экстракта, большая длительность проведения анализа. При использовании диэтилового эфира для выделения салициловой кислоты из вегетативных органов растений в раствор перейдут не только салициловая кислота, но и другие сопутствующие, растворимые в диэтиловом эфире соединения. При анализе сложных по составу биологических проб методом капиллярного электрофореза происходит быстрое загрязнение разделяющего капилляра.

Задачей изобретения является экспрессный анализ, включающий выделение салициловой кислоты из растительного материала, эффективное разделение и определение содержания салициловой кислоты методом капиллярного электрофореза, обеспечение экспрессных и достоверных количественных результатов при минимальных затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения салициловой кислоты методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа.

Технический результат достигают за счет того, что способ определения салициловой кислоты предусматривает экстракционную пробоподготовку образца биологического материала 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия, центрифугирование, анализ экстракта методом капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс, борной кислоты, 0,05% масс, тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (рН 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Для калибровки прибора используют стандартные водные растворы салицилата натрия.

Способ определения содержания салициловой кислоты в растительной ткани предусматривает экстракционную пробоподготовку биологического материала, центрифугирование, и отличается тем, что для выделения салициловой кислоты из растительной ткани используется водный 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия и количественное определение содержания салициловой кислоты в виде натриевой соли проводится на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс, борной кислоты, 0,05% масс, тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (рН 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Поставленная задача достигается за счет того, что салициловая кислота выделяется из растительной ткани водным раствором гидрокарбоната натрия в виде натриевой соли хорошо растворимой в воде, свойства ведущего электролита позволяют исключить из процесса многостадийную пробоподготовку и обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента при длине волны детектирования 254 нм.

В результате проведенных исследований и сравнения с аналогом установлено, что предлагаемый способ определения содержания салициловой кислоты в растительной ткани предусматривает экстракционную пробоподготовку биологического материала, центрифугирование, и отличается тем, что для выделения салициловой кислоты из растительной ткани используется водный 0,1 М раствор гидрокарбоната натрия и количественное определение содержания салициловой кислоты в виде натриевой соли проводится на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс, борной кислоты, 0,05% масс, тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (рН 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм, позволяет достичь объективного, экспрессного определения массового содержания салициловой кислоты, как в градуировочных растворах, так и в биологических пробах.

Преимущества заявляемого способа заключается в эффективном извлечении салициловой кислоты в виде хорошо растворимой в воде натриевой соли, использовании нетоксичных и доступных реактивов при пробоподготовке, в экспрессности осуществлении анализа на системах капиллярного электрофореза, например, серии «Капель», обеспечении объективности и достоверности анализа образцов, стабильности во времени ведущего электролита, позволяющего исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента. Контролем служило определение содержания салициловой кислоты в этой же пробе согласно способа-прототипа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение содержания салициловой кислоты в вегетативных органах листья проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 99) методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке.

Согласно способа - прототипа 1,00 г листьев проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 99 заливали и гомогенизировали в 10 см³ диэтилового эфира, экстракт отфильтровывали при 4°С. Эфир испаряли на воздухе. Остаток растворяли в 10 см³ 0,1 М водного раствора гидрокарбоната натрия. Содержание салицилата натрия в растворе определяли методом капиллярного электрофореза на системе капиллярного электрофореза 105 М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс, борной кислоты, 0,05% масс, тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (рН 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.(Фигура 1).

Осуществляли подготовку пробы упрощенным способом

При упрощенной пробоподготовке для выделения салициловой кислоты пробу листьев проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 99 массой 1,00 г заливали и гомогенизировали в 10,0 см³ 0,1 М водного раствора гидрокарбоната натрия, центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин при 4°С. Содержание салицилата натрия в супернатанте определяли методом капиллярного электрофореза на системе капиллярного электрофореза 105 М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс, борной кислоты, 0,05% масс, тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (рН 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм. Полученные растворы переносили для анализа в систему капиллярного электрофореза. Анализ осуществляли согласно описанным выше параметрам. (Фигура 2).

Расчет содержания салициловой кислоты проводили по формуле:

где С_х - содержание салициловой кислоты, мг/ г сырой массы; А - содержание салицилата натрия в образце; V_e - объем экстракта, мл; V_a - объем экстракта, взятый для анализа (80 мкл); m - масса образца для экстракции, г; 0,86 - коэффициент пересчета салицилата натрия на салициловую кислоту.

Контролем служило определение салициловой кислоты в этих же растительных образцах, согласно способа - прототипа.

Для проверки надежности метода капиллярного электрофореза использовали метод добавки салицилата натрия в пробу биологического материала. (Фигура 3). Установлено, что степень извлечения салицилата натрия для анализируемых образцов составила 103,5-104,1%.

Эти данные свидетельствуют о возможности корректного определения салициловой кислоты, согласно заявляемого способа.

Предлагаемый способ практически лишен таких недостатков, как необходимость дополнительного разбавления проб для корректного анализа, влияние мешающих веществ биологической природы - фенольные соединения, водный раствор ведущего электролита стабилен во времени и не загрязняет внутреннюю поверхность капилляра.

При реализации способа получены количественные результаты определения массовой концентрации салициловой кислоты, превосходящие по своему качеству прототип.

Пример 2 Определение содержания салициловой кислоты в листьях винограда (сорта Бианка) методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке.

Аналогично примера 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья винограда сорта Бианка.

Пример 3 Определение содержания салициловой кислоты в листьях яблони сорта Айдаред методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке.

Аналогично примера 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья яблони сорта Айдаред.

Результаты определения содержания салициловой кислоты, мг/г:

- объект - листья проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 99 стандартная пробоподготовка (способ - прототип) 0,906 мг/г

упрощенная пробоподготовка 3,056 мг/г

- объект - листья винограда сорта Бианка

стандартная пробоподготовка (способ - прототип) 1,05 мг/г

упрощенная пробоподготовка 3,14 мг/г

- объект - листья яблони сорта Айдаред

стандартная пробоподготовка (способ - прототип) 1,32 мг/г

упрощенная пробоподготовка 3,27 мг/г.

Применение заявляемого способа позволило получить воспроизводимый результат в случае упрощенной пробоподготовки для объектов примеров 1-3.

Для проверки надежности метода упрощенной пробоподготовки пробы, реализованного в примере 1, использовали метод добавки салициловой кислоты в пробу биологического материала и проводили экстракционную пробоподготовку. Установлено, что степень извлечения салициловой кислоты для анализируемого образца составила 102-104%.

Эти данные свидетельствуют о возможности корректного определения салициловой кислоты согласно примера 1 (упрощенная пробоподготовка).

Предлагаемый способ практически лишен таких недостатков, как необходимость длительной очистки проб для корректного анализа, влияние мешающих веществ биологической пробы - фенольных соединений, водный раствор ведущего электролита стабилен во времени и не загрязняет внутреннюю поверхность капилляра. При реализации способа получены количественные результаты определения массовой концентрации салициловой кислоты, превосходящие по качеству прототип. Примеров 3, Фигур 3.