Способ определения натамицина методом капиллярного электрофореза

Изобретение относится к винодельческой продукции, в частности к способам определения антибиотиков-консервантов в виноматериалах и винах.

Антибиотики, а именно натамицин, относятся к группе тетраеновых макролидов. Данное вещество влияет на морфологию вакуолей в дрожжевых клетках. Кроме того, в плесневых грибах натамицин провоцирует остановку их размножения. Его механизм действия связан с ингибированием активных процессов мембраны клетки, слияния вакуолей и действия белков-переносчиков.

Обладающий широким спектром активности - натамицин способен замедлить рост и развитие дрожжей и плесневых грибов при низкой концентрации [Малова, И.О., Натамицин - противогрибковое средство класса полиеновых макролидов с необычными свойствами / И.О. Малова, Д.Д. Петрухин. // Вестник дерматологии и венерологии - Москва, 2015, №3. - 161-184 с.].

На сегодняшний день натамицин может быть определен несколькими способами. Метод жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением в масс-спектрометрии с высоким разрешением в положительном режиме (LC-ESI-HR-MS), также является вариантом определения натамицина в винах. Стандартный раствор растворяли в смеси из метанола, воды и уксусной кислоты (50:47:3, об./об./об.). Основной исходный раствор натамицина (1 г/дм³) получали, растворяя 10 мг натамицина в 10 мл стандартного разбавителя. Натамицин - рабочий раствор I (10 мг/дм³) готовят путем разбавления 100 мкл первичного исходного раствора до 10 мл в мерной колбе со стандартным разбавителем. Натамицин рабочий раствор II (500 мг/дм³) получали путем разбавления 500 мл рабочего раствора от 1 до 10 мл в мерной колбе со стандартным разбавителем [Roberts, D. Development and validation of a rapid method for the determination of natamycin in wine by high- performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry / Dominic P.T. Roberts, Michael J. Scotter, Michal Godula, Michael Dickinson and Adrian J. Charlton // Analytical Methods, The Royal Society of Chemistry, 2011. - v. 3 - C. 937-943].

Известен эффективный метод для определения остатков натамицина в образцах вина путем экстракции растворителем и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографией, связанной с тандемной масс-спектрометрией (UHPLC-MS / MS). Для пробоподготовки использовали твердофазную экстракцию с различными количествами сорбентов С18 и первичного вторичного амина (PSA) для оптимизации этапа очистки. В качестве растворителя для экстракции использовали ацетонитрил. Ограничение метода обнаружения (LOD) и количественная оценка (LOQ) составляют 1,5 и 5,0 мкг/дм³ соответственно [Bernardi, G. Fast Sample Preparation Method Using Ultra-High Performance Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry for Natamycin Determination in Wine Samples / Gabrieli Bernardi et al. // J. Braz. Chem. Soc., 2017. - Vol. 28.- No. 5. - C. 831-836].

Недостатками вышеперечисленных методов заключаются в необходимости использования больших объемов токсичных растворов, трудоемкой процедуры пробоподготовки. Немаловажным является высокая стоимость оборудования, затраты на ее обслуживание и ремонт по сравнению с системой высокоэффективного капиллярного электрофореза.

Известен способ определения антибиотиков с помощью системы капиллярного электрофореза в готовых лекарственных средствах, разработанный специалистами Группы компаний «ЛЮМЭКС». К таковым готовым лекарственным средствам относится диоксидин, амоксициллин тригидрат, колистин сульфат, норфлоксацин, тилозин тартрат и др. Метод измерений основан на детектировании по собственному поглощению при длине волны 190/200 нм. Диапазон измерений массовой доли антибиотиков равен 1-1000 г/кг, а в жидких антибиотиках составляет от 1 г/л.

Недостатком является то, что данным способом идентифицируются вещества другого химического класса и применим для ветеринарной отрасли. Следует отметить, что в винодельческой отрасли система капиллярного электрофореза как определения антибиотиков ранее не применялась.

В виноделии, для контроля потребительской безопасности применяется метод двухмерной спектрометрии с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором (ВЭЖХ). С этой целью в исследованиях используют прибор HPLC-MS / MS Agilent 6460 и Agilent RP18. Принцип действия данной хроматографии заключатся в разделении компонентов сложной смеси, основанном на обратимом взаимодействии компонентов пробы, находящихся в растворе с твердым сорбентом. Для определения искомого вещества устанавливается оптимальная длина волны, равная 303 нм, подвижная фаза состоит из ледяной уксусной кислоты, воды и метанола (5/40/60, об./об./об.). Изократическое элюирование со скоростью потока 1,0 мл/мин., температура колонки составляет 30°C [Xiangyu, Sun Detection method optimization, content analysis and stability exploration of natamycin in wine / Xiangyu Sun и др // Food Chemistry, 194, (2016), 928-937.]

Задачей изобретения является эффективное определение антибиотика макролидной группы, а именно, натамицина в виноматериалах и винах, получение экспрессных и достоверных количественных данных при минимальных временных и экономических затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность полученных результатов, а также исключает применение токсичных и дорогостоящих реактивов.

Достоверное определение натамицина в виноматериалах и винах достигается посредством применения метода высокоэффективного капиллярного электрофореза при следующих параметрах: длина капилляра 0,5 м, внутренний диаметр - 75 мкм, длина волны - 303 нм.

Сущность изобретения заключается в подпоре параметров и режимов работы системы высокоэффективного капиллярного электрофореза в сочетании с необходимыми условиями анализа. К таковым условиям разделения компонентов пробы относится состав ведущего электролита и оптимальная длина волны. Для достижения результата были про анализированы значения длины волны в диапазоне от 220-318 нм. По результатам проведенной работы выявлено, достоверность качественных и количественных показателей наличия антибиотика в составе виноматериалов и вин возможна только при длине волны равной 303 нм.

Приготовлен стандартный раствор натамицина концентрацией 100 мг/дм³ путем разбавления 0,025 г искомого вещества этиловым спиртом в колбе на 250 мл. Проба образца была разбавлена водой. Для получения результата анализа необходимы точные значения длины волны и компонентов буферного раствора. Был приготовлен ведущий электролит, содержащий 10 мМ тетрабората и 40 мМ додецилсульфата натрия.

Кроме того, рабочее напряжение в системе капиллярного электрофореза варьировалось от +20 кВ, ввод пробы был произведен при давлении, равном 30 мбар в течение 5-25 секунд.

Состав ведущего электролита также подвергался изменению путем отсутствия в нем этилового спирта. В перечень компонентов ведущего электролита был привнесен 5% этиловый спирт и увеличено содержание додецилсульфата натрия до 60 мМ. Установлено время ввода пробы 10 с.

Пример 1 Исходный образец красного вина подвергается разбавлению дистиллированной водой в 5 раз. Подготовленную пробу помещают в пробирку Эппендорфа и центрифугируют 4 минуты при 6000 об/мин. Затем приготавливается стандартный раствор натамицина концентрацией 100 мг/дм и ведущий электролит. Подготовка прибора заключается в кондиционировании капилляра в кислой и щелочной среде с установлением рабочего напряжения, равного 20 кВ при положительной полярности. Подготовленный образец помещают в устройство для ввода проб прибора и проводят измерения в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора, аналогично операциям, выполняемым при градуировке прибора, установив рабочие параметры. Регистрируют пики в области времени миграции натамицина. Образец анализируют два раза в условиях повторяемости. Идентификацию пиков проводят по временам удерживания компонентов, полученных при установлении градуировочной характеристики. В случае затруднения идентификации какого-либо пика, рекомендуется использовать метод добавок. Для этого в анализируемую пробу вносится идентифицируемый компонент с расчетом на увеличение его концентрации на (100±50)% и измерение повторяют. Увеличение высоты соответствующего пика свидетельствует о правильной идентификации.

Пример 2 Аналогично примера 1, в качестве объекта исследования использован виноматериал белый.

Пример 3 Аналогично примера 1, в качестве объекта исследования - концентрированный виноградный сок, который предварительно необходимо разбавить в мерной колбе в 10 раз.

Пример 4 Аналогично примера 1, с установлением длины волны, равной 318 нм были проведены исследования с объектами согласно примеров 1-3. При данных показателях длины волны получение результатов не эффективно.

За прототип обнаружения натамицина в виноматериалах и винах был взят метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полученные результаты, характеризующие способ определения натамицина в вине и виноматериалах отражены в таблице.

Анализ полученных результатов показал, что заявленный способ позволяет определять натамицин в вине. Преимущество заявленного способа выражено в упрощенной процедуре пробоподготовки и отсутствии токсичных реактивов для проведения анализа. Разработанный способ является более рентабельным при контроле потребительской безопасности винодельческой продукции по сравнению со способом-прототипом, в связи со значительно меньшей стоимостью самого прибора.