Результат интеллектуальной деятельности: Применение серебряной соли N-{ 4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил} -1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида в качестве противогрибкового средства в отношении штаммов грибов C. tropicalis, C. krusei и C. glabrata

Изобретение относится к противогрибковому средству на основе серебряной соли N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида формулы (I):

,

что позволяет предположить возможность его применения в медицине в качестве лекарственного противогрибкового средства в отношении грибов Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata.

Ближайшими аналогами по структуре и действию заявляемому соединению являются N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамид (II) и его натриевая соль (III) (Синтез и биологическая активность 5-арил-N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенилпиразол-3-карбоксамидов и их солей / В.Л. Гейн, О.В. Бобровская, А.А. Русских, В.В. Новикова, О.Н. Гейн, Ю.Н. Карпенко, С.В. Чащина, М.В. Дмитриев, А.Н. Янкин // Журн. общей химии. - 2019. - Т. 89, №4. - С. 542-551) формулы:

Структурные аналоги (II, III) обладают низкой противогрибковой активностью (таблица 1) в отношении штаммов грибов Candida albicans и не изучены на наличие противогрибковой активности в отношении штаммов грибов Candida non-albicans: Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata и острой токсичности.

В медицинской практике широко используется флуконазол в качестве противогрибкового лекарственного средства, аналогичное по фармакологическому действию заявляемому соединению (I), которое выбрано нами в качестве эталона сравнения (Машковский М.Д. Лекарственные средства - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, 2012. - С. 920).

Целью изобретения является поиск соединений с высоким противогрибковым действием и низкой токсичностью в ряду серебряных солей 5-арил-N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенилпиразол-3-карбоксамидов.

Поставленная цель достигается применением серебряной соли N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида (I), которая обладает противогрибковой активностью в отношении грибов Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata.

Соединение (I) синтезируют взаимодействием N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида (II) с нитратом серебра в смеси этанол-ДМФА в соотношении 2:1 по схеме:

Синтез исходного N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида (II) осуществлен согласно ранее описанной методики (Синтез и биологическая активность 5-арил-N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенилпиразол-3-карбоксамидов и их солей / В.Л. Гейн, О.В. Бобровская, А.А. Русских, В.В. Новикова, О.Н. Гейн, Ю.Н. Карпенко, С.В. Чащина, М.В. Дмитриев, А.Н. Янкин // Журн. общей химии. - 2019. - Т. 89, №4. - С. 542-551.).

Пример 1. Получение соединения (I).

К горячему раствору 2,18 г (0,004 моль) N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида (II) в 35 мл смеси этанол-ДМФА (2:1) приливали горячий раствор 0,68 г (0,004 моль) серебра нитрата в 34 мл этанола (2% раствор). Выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре от следов серебра нитрата этанолом и водой, сушили, снова промывали этанолом и сушили. Выход 1,75 г (67%). Т. пл. 217-219°С. Найдено, %: С 49.82; H 3.36; N 10.67; S 9.88. C₂₇H₂₂AgN₅O₄S₂. Вычислено, %: С 49.70; H 3.40; N 10.73; S 9.83. ИК спектр (ИК-Фурье спектрометр IRAffinity-1 Shimadzu (Япония), в таблетках с KBr, ν, см^-1): 3494, 3368 (NH), 1688 (CON), 1319, 1139 (SO₂). Спектр ЯМР ¹H (Bruker АМ-300, рабочая частота 300 МГц, DMSO-d₆, TMS, δ, м.д.): 1.30 т (3Н, СН₃СН₂О, J 6.90 Гц), 4.04 к (2Н, СН₃СН₂О, J 6.90 Гц), 6.83 д (1Н, С⁵Н_тиазол, J 4.20 Гц), 7.04 с (1Н, С⁴Н_{пиразол}), 7.19 д (1Н, С⁴Н_тиазол, J 4.20 Гц), 6.86-7.98 м (13Н, CH_Ar), 10.26 с (1Н, CONH).

Соединение (I) представляет собой белое с желтоватым оттенком кристаллическое вещество, растворимое при нагревании в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ледяной уксусной кислоте и нерастворимое в воде, этаноле, изопропаноле.

Пример 2. Исследование противогрибковой активности и острой токсичности соединения (I).

Острую токсичность (ЛД₅₀, мг/кг) соединения (I) изучали на белых мышах (самках) массой 18-22 г при однократном внутрибрюшинном введении (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильева, О.Л. Верстаковой, М.В. Журавлевой, В.К. Лепахина, Н.В. Коробова, В.А. Меркулова, С.Н. Орехова, И.В. Сакаевой, Д.Б. Утешева, А.Н. Яворского. - Ч. 1. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.). За животными вели наблюдение в течение 10 суток, фиксируя поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие судорог, координацию движений, тонус скелетной мускулатуры, реакции на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску видимых слизистых оболочек, потребление воды и пищи, изменение массы тела.

Рассчитывали острую токсичность, соблюдая рекомендации государственного фармакологического комитета по изучению общетоксического действия биологически активных веществ (Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утв. 25. 12. 97 / Вестн. фармакоп. комитета. - 1998. - №1. - С. 27-32).

Установлено, что ЛД₅₀ для заявляемого соединения (I) составляет>1000 мг/кг. Внутрибрюшинное введение животным высоких доз изучаемого соединения (I) 1000 мг/кг не приводило к гибели животных. Следовательно, ЛД₅₀ соединения (I) находится в дозах больших, чем 1000 мг/кг. Соответственно заявляемое соединение (I) по токсичности не уступает эталону сравнения флуконазолу, ЛД₅₀ которого 1273 мг/кг (Режим доступа: https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/name/fluconazole).

Согласно классификации токсичности препаратов соединение (I) относится к классу практически нетоксичных веществ (Измеров, Н.Ф. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном воздействии (справочник) / Н.Ф. Измеров, И.В. Саноцкий, К.К. Сидоров - М.: Медицина, 1977. - С. 196-197).

Противогрибковую активность заявляемого соединения (I) определяли пробирочным методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильева, О.Л. Верстаковой, М.В. Журавлевой, В.К. Лепахина, Н.В. Коробова, В.А. Меркулова, С.Н. Орехова, И.В. Сакаевой, Д.Б. Утешева, А.Н. Яворского. - Ч. 1. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.).

Скрининг противогрибковой активности осуществляли в отношении типовых штаммов Candida albicans АТСС 885-653, Candida tropicalis РКПГΥ-1513/784, Candida krusei РКПГΥ-1472/310, Candida glabrata РКПГΥ-1485/47. Исследуемое соединение массой 0,05 г растворяли в 5 мл ДМСО, получая основной раствор вещества в концентрации 10⁴ мкг/мл. Данный раствор служил основой для рабочего раствора, имеющего концентрацию 2×10³ мкг/мл, который последовательно разводили двукратно в жидкой питательной среде в ряду из 10 пробирок. Концентрация исследуемого соединения в первой пробирке ряда разведений в питательной среде составляла 1000,0 мкг/мл. Для определения противогрибковой активности использовали бульон Сабуро (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Для приготовления взвеси дрожжевых культур применяли двухсуточные культуры, выращенные на агаре Сабуро. Концентрация микробных клеток в опыте составила 2-5×10⁴ КОЕ/мл. В качестве положительного контроля использовали питательную среду с внесенной исследуемой культурой. В качестве отрицательного контроля использовали интактную питательную среду. Посевы инкубировали в термостате при температуре 25±2°С. Оценку антимикотической активности осуществляли визуально на 40-48 ч инкубирования. Исследования проводили в двух повторах. В качестве значения МПК (минимальной подавляющей концентрации) принимали концентрацию соединения в последней прозрачной пробирке серии разведения.

Фунгистатический эффект заявляемого соединения (I) сравнивали с экспериментальными и литературными данными флуконазола (Minimum inhibitory concentrations of amphotericin В, azoles and caspofungin against Candida species are reduced by farnesol / R.A. Cordeiro, C.E.C. Teixeira, R.S.N. Brilhante [et al.] // Medical Mycology. -2013. - Vol. 51, Iss. 1. - P. 53-59). Кроме того, противогрибковую активность заявляемого соединения (I) сравнивали с активностью аналогов по структуре (II, III). Результаты испытаний представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, структурные аналоги (II, III) обладают низкой противогрибковой активностью. Введение в структуру пиразол-3-карбоксамида (II, III) ионов серебра с образованием серебряной соли N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида (I) приводит к резкому усилению биологического действия в отношении изучаемой культуры. Заявляемое соединение (I) по противогрибковой активности превосходит эффект эталона сравнения флуконазола в отношении Candida albicans АТСС 885-653 ~ в 2-64 раза (МПК 2,0/1,0 и 64,0/1,0).

В связи с наличием высокой противогрибковой активности заявляемого соединения (I) в отношении типового штамма Candida albicans АТСС 885-653 было изучено его действие на другие штаммы грибов рода Candida. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Проведенные исследования показали наличие у заявляемого соединения (I) высокой антифунгальной активности, превосходящей эффект эталона сравнения флуконазола в отношении изученных штаммов C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata (табл. 2).

Таким образом, серебряная соль N-{4-[(1,3-тиазол-2-ил)сульфамоил]фенил}-1-фенил-5-(4-этоксифенил)пиразол-3-карбоксамида (I) проявляет высокую противогрибковую активность, которая превышает действие структурных аналогов (II, III) и эталона сравнения флуконазола, а также является практически нетоксичной, что делает возможным - использование ее для создания нового лекарственного средства, обладающего антифунгальной активностью.