Серебряные соли 3,4-диарил-5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов, проявляющие противогрибковую активность

Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса 3,4-диарил-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-она, а именно к серебряным солям 3,4-диарил-5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов формулы (I, II, III):

R₁=4-СН₃О, R₂=4-Cl (I), R,=4-СН₃О, R₂=2-NO₂ (II), R₁=4-Br, R₂=2-NO₂ (III),

обладающим противогрибковой активностью, что позволяет предположить возможность их использования в медицине в качестве лекарственных противогрибковых средств.

Ближайшими аналогами по структуре и действию заявляемым соединениям являются 3,4-диарил-5-(4-гуанидилсульфонилфенил)-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-оны (IVa-ё) [Синтез и антибактериальная активность 3,4-диарил-5-(4-гуанидилсульфонилфенил)-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов / О.В. Бобровская, И.В. Ковтоногова, В.Л. Гейн [и др.] // Хим.-фарм. журн. - 2016. - Т. 50. - №1. - С. 17-18] формулы:

R=4-Cl (IVa-д), H (IVe, ё);

R₁=4-Cl (IVa), 4-NO₂ (IVб), 3-NO₂ (IVв), H (IVг), 4-Br (IVд), 4-F (IVе), 3-F (IVё).

Структурные аналоги (IVa-ё) обладают низкой противогрибковой активностью.

Эталоном сравнения выбран флуконазол, широко применяемый в лечебной практике и являющийся аналогом по действию заявляемым соединениям (I, II, III) [Машковский М.Д. Лекарственные средства.- 16-е изд., перераб., испр. и доп.- М.: Новая волна, 2012. - С. 920-921]. Кроме того, в качестве эталона сравнения взято известное лекарственное средство сульфацетамид натрия (сульфацил-натрий), который используется нами как исходное вещество в синтезе соединений (I, II, III) и является аналогом по структуре [Машковский М.Д. Лекарственные средства.- 16-е изд., перераб., испр. и доп.- М.: Новая волна, 2012. - С. 826-827].

Целью изобретения является поиск соединений с высоким противогрибковым действием и низкой токсичностью в ряду 3,4-диарил-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов.

Поставленная цель достигается получением серебряных солей 3,4-диарил-5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-4,6-дигидропирроло [3,4-с]пиразол-6-онов (I, II, III), которые обладают противогрибковой активностью.

Заявляемые соединения (I, II, III) синтезируют взаимодействием 3,4-диарил-5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов (V) с серебра нитратом в среде этанол-ДМФА в соотношении 2:1 по схеме:

R₁=4-СН₃О, R₂ = 4-Cl (I), R₁=4-СН₃О, R₂=2-NO₂ (II), R₁=4-Br, R₂=2-NO₂ (III).

Синтез исходных 5-арил-4-ароил-1-(4-ацетиламиносульфонилфенил)-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов (VI) и 3,4-диарил-5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов (V) осуществлен по аналогии с ранее описанными методиками [Синтез 5-арил-4-ароил-3-гидрокси-1-(4-гуанидилсульфонилфенил)-3-пирролин-2-онов / В.Л. Гейн, И.В. Ковтоногова, О.В. Бобровская [и др.] // Журн. общей химии. - 2014. - Т. 84, вып. 2. - С. 271-274; Синтез и антибактериальная активность 3,4-диарил-5-(4-гуанидилсульфонилфенил)-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов / О.В. Бобровская, И.В. Ковтоногова, В.Л. Гейн [и др.] // Хим.-фарм. журн. - 2016. - Т. 50. - №1. - С. 17-18].

Пример 1. Получение заявляемого соединения (I). К горячему раствору 1,07 г (0,002 моль) 5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-3-(4-метоксифенил)-4-(4-хлорфенил)-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-она (V) в 30 мл смеси этанол-ДМФА в соотношении 2:1 добавляют горячий раствор 0,34 г (0,002 моль) серебра нитрата в 17 мл этанола (2% раствор). Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывают, промывают на фильтре от следов серебра нитрата этанолом и водой, высушивают, снова промывают этанолом и высушивают. Выход 0,81 г (63%). Т.пл. 277-279°С. Найдено, %: С 48.61; Н 3.08; N 8.79; S 4.92. C₂₆H₂₀AgClN₄O₅S. Вычислено, %: С 48.50; Н 3.13; N 8.70; S 4.98. ИК спектр (Specord М-80, в таблетках с KBr, ν, см^-1): 3400 (NH), 1720 (СО_лакт.), 1664 (СО_амид.), 1344, 1160 (SO₂). Спектр ЯМР ¹Н (Bruker Avance III HD, рабочая частота 400 МГц, DMSO-d₆, TMS, δ, м.д.): 1.92 с (3Н, СН₃СО), 3.74 с (3Н, CH₃O), 6.82 с (1Н, С₍₄₎Н), 6.90-7.95 м (12Н, СН_аром), 13.91 с (1H, N₍₁₎H).

Заявляемое соединение (I) представляет собой белое с желтоватым оттенком кристаллическое вещество, растворимое при нагревании в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ледяной уксусной кислоте и не растворимое в воде.

Пример 2. Получение заявляемого соединения (II). К горячему раствору 1,09 г (0,002 моль) 5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-3-(4-метоксифенил)-4-(2-нитрофенил)-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-она (V) в 35 мл смеси этанол-ДМФА в соотношении 2:1 добавляют горячий раствор 0,34 г (0,002 моль) серебра нитрата в 17 мл этанола (2% раствор). Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывают, промывают на фильтре от следов серебра нитрата этанолом и водой, высушивают, снова промывают этанолом и высушивают. Выход 0,86 г (66%). Т.пл. 233-235°С. Найдено, %: С 47.62; Н 3.12; N 10.62; S 4.93. C₂₆H₂₀AgN₅O₇S. Вычислено, %: С 47.72; Н 3.08; N 10.70; S 4.90. ИК спектр (Specord М-80, в таблетках с KBr, ν, см^-1): 3384 (NH), 1736 (СО_лакт.), 1636 (СО_амид.), 1340, 1160 (SO₂). Спектр ЯМР ¹H (Bruker Avance III HD, рабочая частота 400 МГц, DMSO-d₆, TMS, δ, м.д.): 1.89 с (3Н, СН₃СО), 3.69 с (3Н, CH₃O), 6.75 с (1Н, С₍₄₎Н), 6.83-7.80 м (12Н, СН_аром), 13.98 с (1Н, N₍₁₎H).

Заявляемое соединение (II) представляет собой бледно-желтое кристаллическое вещество, растворимое при нагревании в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ледяной уксусной кислоте и не растворимое в воде.

Пример 3. Получение заявляемого соединения (III). К горячему раствору 1,19 г (0,002 моль) 5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-3-(4-бромфенил)-4-(2-нитрофенил)-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-она (V) в 35 мл смеси этанол-ДМФА в соотношении 2:1 добавляют горячий раствор 0,34 г (0,002 моль) серебра нитрата в 17 мл этанола (2% раствор). Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывают, промывают на фильтре от следов серебра нитрата этанолом и водой, высушивают, снова промывают этанолом и высушивают. Выход 1,00 г (71%). Т.пл. 268-270°С. Найдено, %: С 42.82; Н 2.40; N 10.02; S 4.51. C₂₅H₁₇AgBrN₅O₆S. Вычислено, %: С 47.70; Н 2.44; N 9.96; S 4.56. ИК спектр (Specord М-80, в таблетках с KBr, ν, см^-1): 3400 (NH), 1720 (СО_лакт.), 1636 (СО_амид.), 1348, 1164 (SO₂). Спектр ЯМР ¹H (Bruker Avance III HD, рабочая частота 400 МГц, DMSO-d₆, TMS, δ, м.д.): 1.87 с (3Н, СН₃СО), 7.18 с (1H, С₍₄₎Н), 7.37-7.84 м (12Н, СН_аром.), 13.80 с (1H, N₍₁₎H).

Заявляемое соединение (III) представляет собой белое с сероватым оттенком кристаллическое вещество, растворимое при нагревании в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ледяной уксусной кислоте и не растворимое в воде.

Исследование противогрибковой активности и острой токсичности заявляемых соединений (I, II, III).

Острую токсичность (ЛД₅₀, мг/кг) соединений (I, II, III) изучали на белых мышах (самках) массой 16-18 г при однократном внутрибрюшинном введении. За животными вели наблюдение в течение 10 суток, фиксируя поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие судорог, координацию движений, тонус скелетной мускулатуры, реакции на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску видимых слизистых оболочек, потребление воды и пищи, изменение массы тела.

Рассчитывали острую токсичность, соблюдая рекомендации государственного фармакологического комитета по изучению общетоксического действия биологически активных веществ [Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утв. 25. 12. 97 / Вестн. фармакоп.комитета. - 1998. - №1. - С. 27-32].

Установлено, что ЛД₅₀ составляет для соединения (I) 1350 мг/кг, для соединений (II, III) > 1200 мг/кг. Следовательно, заявляемые соединения (I, II, III) менее токсичны, чем эталон сравнения флуконазол, ЛД₅₀ которого 1273 мг/кг [Drugs in Japan V., P. 983, 1990. - Режим доступа: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/chemidlite.jsp]. Согласно классификации токсичности препаратов соединения (I, II, III) относятся к классу практически нетоксичных веществ [Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном воздействии (справочник). - М.: Медицина, 1977. - С. 196-197].

Противогрибковую активность определяли методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. - Ч. 1. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 576-578.]. Для всех испытуемых соединений (I, II, III) были определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) в отношении фармакопейных штаммов Candida albicans АТСС 885-653 и Candida albicans АТСС 10231, полученных из ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России. Посевы производили в жидкую среду Сабуро с различной концентрацией испытуемых соединений. Исследуемые соединения в количестве 0,05 г растворяли в 5 мл диметилсульфоксида, 1 мл полученного разведения 1:100 соединяли с 4 мл жидкой среды Сабуро. Далее готовили ряд серийных разведений соединений с двукратно уменьшающейся концентрацией.

Культуры выращивали в пробирках на скошенной агаризированной среде (плотная среда Сабуро). Для определения противогрибковой активности использовалась 48 часовая культура. Для приготовления рабочей взвеси микроорганизмов производили смыв выросшей культуры изотоническим раствором натрия хлорида и устанавливали плотность микробной взвеси по стандарту мутности 5 единиц. Далее из полученной микробной взвеси готовили рабочий раствор с концентрацией 5x10⁵ КОЕ/мл. Данную взвесь вносили в количестве 0,1 мл в пробирки с серийными разведениями изучаемых соединений. Таким образом, микробная нагрузка при определении противогрибковой активности составила 2-2,5×10⁴ КОЕ/мл

Учет результатов производили через 48 часов выдержки контрольных и опытных пробирок в термостате при температуре 24°С±1°С Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) устанавливали по отсутствию признаков роста на питательной среде: последняя пробирка с задержкой роста (прозрачная) соответствует МПК соединения в отношении данного штамма.

Фунгистатический эффект исследуемых соединений (I, II, III) сравнивали с действием флуконазола [Cordeiro R.A., Teixeira С.Е. С, Brilhante R.S. N. et al / Minimum inhibitory concentrations of amphotericin B, azoles and caspofungin against Candida species are reduced by farnesol // Medical Mycology January 2013, 51, P. 53-59]. Кроме того, в качестве эталона сравнения использовали сульфацетамид натрия (сульфацил-натрий), который является исходным веществом в синтезе соединений (I, II, III) и аналогом по структуре. Результаты испытаний представлены в таблице 1.

* - литературные данные.

Как видно из таблицы 1, серебряные соли 3,4-диарил-5-[4-(ацетиламиносульфонил)фенил]-4,6-дигидропирроло[3,4-с]пиразол-6-онов (I, II, III) по противогрибковой активности сравнимы с современным антимикотиком флуконазолом и превосходят аналог по структуре (сульфацетамид натрия) в 128-500 раз (МПК 1000/7,8 и 1000/2), а также менее токсичны, чем флуконазол.

Следовательно, заявляемые соединения (I, II, III) могут найти применение в медицине в качестве противогрибковых лекарственных средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Синтез и антибактериальная активность 3,4-диарил-5-(4-гуанидилсульфонилфенил)-4,6-дигидропирроло [3,4-с]пиразол-6-онов / О.В. Бобровская, И.В. Ковтоногова, В.Л. Гейн [и др.] // Хим.-фарм. журн. - 2016. -Т. 50.-№1.-С. 17-18.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства.- 16-е изд., перераб., испр. и доп.- М.: Новая волна, 2012. - С. 826-827, С. 920-921.

3. Синтез 5-арил-4-ароил-3-гидрокси-1-(4-гуанидилсульфонилфенил)-3-пирролин-2-онов / В.Л. Гейн, И.В. Ковтоногова, О.В. Бобровская [и др.] // Журн. общей химии. - 2014. - Т. 84, вып. 2. - С. 271-274.

4. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утв. 25. 12. 97 / Вестн. фармакоп.комитета. - 1998. -№1.-С. 27-32.

5. Drugs in Japan V., P. 983, 1990. - Режим доступа: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/chemidlite.jsp

6. Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном воздействии (справочник). - М.: Медицина, 1977. - С. 196 - 197.

7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств.-Ч. 1.-М.: Гриф и К, 2012.-С. 576-578.

8. Cordeiro R.A., Teixeira С.Е. С, Brilhante R.S. N. et al /Minimum inhibitory concentrations of amphotericin B, azoles and caspofungin against Candida species are reduced by farnesol // Medical Mycology January 2013, 51, P. 53-59.