ШТАММ RHODOCOCCUS RUBER ИЭГМ 346 - БИОДЕСТРУКТОР ДИКЛОФЕНАКА НАТРИЯ

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности биодеструкции органических соединений с помощью микроорганизмов.

В настоящее время остро стоит проблема фармацевтического загрязнения окружающей среды: в водных объектах 71 страны мира обнаружено более 600 химических веществ, относящихся к фармацевтическим препаратам. Чаще всего и в сравнительно значительных концентрациях (от нескольких сотен нанограмм до десятков-сотен микрограмм на литр) - это тотально применяемые антибиотики, анальгетики инестероидные противовоспалительные средства (НПВС), гормоны, спазмолитики, антидепрессанты, терапевтические средства для лечения рака, а также статины и противодиабетические препараты, все чаще потребляемые в связи с распространением малоподвижного образа жизни людей, обусловленного урбанизацией [Fatta-Kassinos D., Meric S., Nikolaou A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. V. 399. P. 251-275; aus der Beek Т., Weber F.A., Bergmann A., Hickmann S., Ebert I., Hein A., A. Pharmaceuticals in the environment - Global occurrences and perspectives // Environmental Toxicology and Chemistry. 2016. V. 35. P. 823-835].

В связи с этим интерес представляет углубленное изучение степени биодоступности и токсического воздействия фармполлютантов на природные микроорганизмы, играющие роль системы первичного реагирования для включения специфических функций по утилизации поступающих ксенобиотиков, а также особенностей начальных этапов их разложения и кометаболизма.

Среди микроорганизмов, участвующих в процессах самоочищения природных экосистем, важная экологическая роль в биологической детоксикации и деконтаминации почв и воды принадлежит актинобактериям рода Rhodococcus - устойчивым обитателям загрязненных почв, водоемов, активных илов, сточных вод, обладающим высокой активностью оксидоредуктаз, богатыми адаптивными возможностями в отношении различных токсических соединений, а также высоким потенциалом для биоремедиации загрязненных объектов [Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko A.V. Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in eco-biotechnology and bioremediation // In: I. (Ed.), Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press, Cambridge. 2017. pp. 121-148]. Актуальность использования метаболического потенциала родококков для биодеградации фармвеществ подтверждается все возрастающим числом их исследований [Yoshimoto Т., Nagai F., Fujimoto J., Watanabe K., Mizukoshi H., Makino Т., Kimura K., Saino H., Sawada H., Omura H. Degradation of estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolates from activated sludge in wastewater treatment plants // Applied and Environmental Microbiology. 2004. V. 70(9). P. 5283-5289; Gauthier H., Yargeau V., Cooper D.G. Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus niger by co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. V. 408. P. 1701-1706; Ivshina I.B., Vikhareva E.V., Richkova M.I., Mukhutdinova A.N., Karpenko Ju.N. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 //World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2012. V. 28(10). P. 2997-3006; Larcher S., Yargeau V. Biodegradation of 17-б-ethinilestradiol by heterotrophic bacteria // Environmental Pollution. 2013. V. 173. P. 17-22].

Одним из наиболее часто детектируемых в среде фармполлютантов является диклофенак (C₁₄H₁₁Cl₂NO₂; 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусная кислота; син. Вольтарен®, Ортофен®), широко доступный и часто применяемый в мировой медицинской практике и в ветеринарии полициклический НПВС из группы производных фенилуксусной кислоты, обладающий выраженным противовоспалительным действием, а также мощным анальгетическим, антипиретическим и противоопухолевым эффектом [Altman R., Bosch В., Brune K., Patrignani P., Young C. Advances in NSAID development: evolution of diclofenac products using pharmaceutical technology // Drugs. 2015. V. 75. P. 859-877].

Диапазон фактических концентраций диклофенака в грунтовых, поверхностных (в том числе морских), сточных водах и даже питьевых водах по всему миру варьирует от 0,02 нг/л до 20,00 мкг/л [Khan U., Nicell J. Human health relevance of pharmaceutically active compounds in drinking water // AAPS Journal. 2015. V. 17. P. 558-585; Sui G., Cao X., Lu S., Zhao W., Qiu Z, Yu G. Occurrence, sources and fate of pharmaceuticals and personal care product in the ground water: A review // Emerging Contaminants. 2015. V. 1. P. 14-24; Alygizakis N.A., Gago-Ferrero P., Borova V.L., Pavlidou A., Hatzianestis I., Thomaidis N.S. Occurrence and spatial distribution of 158 pharmaceuticals, drugs of abuse and related metabolites in offshore seawater // Science of the Total Environment. 2016. V. 54. P. 1097-1105; Rivera-Jaimes J.A., Postigo C., R.M., J., D., de Alda M. Study of pharmaceuticals in surface and wastewater from Cuernavaca, Morelos, Mexico: Occurrence and environmental risk assessment // Science of the Total Environment. 2018. V. 613-614. P. 1263-1274].

Наличие двух ароматических колец и двух атомов хлора в химической структуре диклофенака, термодинамическая стабильность бензольного кольца обусловливают высокую устойчивость этого ароматического хлорированного азотсодержащего соединения к биоразложению, токсичность, способность к персистированию и, следовательно, опасность для окружающей среды [ М., Zezulka ., Babula P., J. Possible ecological risk of two pharmaceuticals diclofenac and paracetamol demonstrated on a model plant Lemna minor // Journal of Hazardous Materials. 2015. V. 302. P. 351-361].

Поскольку использование традиционных физико-химических методов и новых окислительных технологий утилизации фармацевтических загрязнителей экологически не безопасно и трудозатратно, остается потребность в инновационных технологиях, направленных на эффективную детоксикацию и выведение органических микрозагрязнителей из водных и сухопутных экосистем.

Приоритет по показателям эффективности, безопасности и экономичности признается за биотехнологическими способами конверсии этих экологических стрессоров. Однако работы по биоконверсии диклофенака пока немногочисленны и в основном проведены с использованием эукариотных организмов, в частности базидиомицетов (Bjerkandera, Trametes, Phanerohaete), зигомицетов (Cunninghamella) и энтомопатогенных (Beauveria). Малоизвестно о бактериальной деградации диклофенака, за исключением единичных работ биотрансформации диклофенака Грамположительными бактериями Actinoplanes и Brevibacterium, Грамотрицательными бактериями Labrys, а также микроорганизмами активного ила [Domaradzka D., Guzik U., Wojcieszyn'ska D. Biodergadation and biotransformation of polycyclic non-steroidal anti-inflammatory drugs // Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 2015. V. 14. P. 229-239; Moreira S., Bessa V.S., Murgolo S., Piccirillo C., Mascolo G., Castro P.M.L. Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2018. V. 152. P. 104-113]. Недостаточно информации о метаболических путях диклофенака натрия: описаны лишь первичные продукты биодеструкции фармвещества, конечные же продукты метаболизации диклофенака до сих пор остаются неизвестными. Однако характеристика метаболитов, образующиеся в процессе деградации диклофенака, и их свойств необходимы для эффективной работы систем очистки сточных вод и оценки экологической ситуации в окружающей среде.

Таким образом, важной технической проблемой является поиск активного штамма-биодеструктора экофармполлютанта диклофенака натрия.

Для решения этой проблемы были использованы биоресурсы Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов [акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768, http://www.iegmcol.ru; реестровый номер УНУ www.ckp-rf.ru/usu/73559] и осуществлен поиск наиболее активных штаммов-биодеструкторов диклофенака натрия. Отобран штамм Rhodococcus rubber ИЭГМ 346, характеризующийся выраженной эмульгирующей и биодеструктивной способностью в отношении индивидуальных углеводородов и нефтепродуктов, устойчивостью к Cu²⁺, Мо⁶⁺, Pb²⁺ (5,0 мМ), а также стабильной активностью в условиях экстремальной кислотности (рН 2-6) и засоленности (2-6% NaCl) среды (http://www.iegmcol.ru/strains/rhodoc/ruber/r_ruber346.html).

Технический результат описываемого изобретения заключается в эффективной биодеструкции штаммом R. ruber ИЭГМ 346 диклофенака натрия. Следует особо отметить, что в результате биоконверсии фармполлютанта данным штаммом происходит разрыв C-N связи и раскрытие хинонового цикла.

Штамм Rhodococcus rubber ИЭГМ 346 выделен в естественных условиях из бытовой сточной воды в г. Харбин, КНР. Штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) под номером ВКПМ АС-2106.

Данный штамм характеризуется следующими признаками:

- Культурально-морфологические признаки: Грамположительные неподвижные плеоморфные одиночные клетки с закругленными концами размером 0,5-1,0×4,1-6,0 мкм, неспороносные, не образующие эндоспор. Клетки ветвятся, ветвление является рудиментарным (ограниченным Y-T-V или L-формами). Формируются первичные гифы, которые фрагментируются. В результате фрагментации образуются палочки. Конидий не образуют.

Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе смеси мясного экстракта и пептонов. На агаре образует колонии размером 2-3 мм (через неделю 4-5 мм). Колонии выпуклые, круглые с ровным краем, не прозрачные, маслянистой консистенции. Клетки содержат каротиноидные пигменты, образование которых стимулируется светом. Поверхность колонии гладкая и блестящая. Сплошной рост на агаре происходит через неделю, рост в жидкой среде в виде поверхностной пленки.

Клетки характеризуются наличием включений крахмала, поли-3-бета-1-оксимасляной кислоты, полифосфата (волютина), гликогена, липидных глобул.

- Физиолого-биохимические признаки: культура растет на синтетических минеральных средах в отсутствии витаминов (ростовых факторов) и органических соединений азота при условии обеспечения другими источниками углерода и энергии. В качестве единственного источника азота могут служить нитраты и соли аммония. Катаболизирует D-глюкозу, пируват, лактат, D-фруктозу, L-рамнозу, D-маннозу, мальтозу, сахарозу, D-маннит, D-сорбит. Использует 1-бутанол, 2-бутанол, 1-октанол, этанол; уксусную, капроновую, масляную, янтарную, DL-молочную, лимонную, пировиноградную, бензойную, мета-оксибензойную, пара-оксибензойную, гамма-аминомасляную и фумаровую кислоты. Использует в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как н-пропан (С₃), н-бутан (С₄), н-пентан (С₅), н-нонан (С₉), н-декан (С₁₀), н-ундекан (С₁₁), н-додекан (С₁₂), н-тридекан (С₁₃), н-тетрадекан (С₁₄), н-пентодекан (С₁₅), н-гексадекан (С₁₆). Не катаболизирует L-арабинозу, D-ксилозу, D-галактозу, L-сорбозу, альфа-метил-D-глюкозид, целлобиозу, лактозу, раффинозу, крахмал, метанол, дульцит; муравьиную, пальмитиновую, альфа-кетоглутаровую, фталевую, терефталевую, изофталевую кислоты. Нитраты восстанавливает до нитритов, разлагает перекись водорода.

На стандартных лабораторных средах оптимум роста - при температуре 28°С, рН 6,8-7,0. Углеводородокисляющая активность (в минеральной среде Киевская (Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. - М.: Наука, 1994. - 163 с.) с добавлением 3 об. % н-гексадекана (C₁₆), условия культивирования: 28°С, 160 об/мин, 5 сут).

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Динамика биодеструкции диклофенака натрия клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 в присутствии глюкозы.

В работе использовали 104 штамма родококков из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов [ИЭГМ, www.iegmcol.ru/strains/index.html]. Культуры принадлежали к десяти видам Rhodococcus: R. cercidiphylli (1 штамм), R. corynebacterioides (2 штамма), R. erythropolis (41 штамм), R. jostii (3 штамма), R. koreensis (1 штамм), R. pyridinivorans (2 штамма), R. qingshengii (4 штамма), R. rhodochrous (8 штаммов), R. ruber (41 штамм), R. wratislaviensis (1 штамм). Выбор штаммов обоснован географией и источником выделения, а также известной каталитической активностью родококков по отношению к сложным органическим соединениям.

Диклофенак натрия (C₁₄H₁₀Cl₂NNaO₂, CAS 15307-86-5, 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусная кислота в виде натриевой соли) использовали в виде фармацевтической субстанции (светло-бежевый кристаллический порошок без запаха, чистота - 99,0% в пересчете на сухое вещество, умеренно растворимый в воде, производство Kairav Chemicals Ltd, Индия).

Химические реагенты, в том числе ацетонитрил, метанол, хлороформ, этанол имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или о.с.ч. (Криохром, Россия; Merck, Германия; Sigma-Aldrich, США). Для получения ультрачистой воды для высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали Millipore Simplicity Personal Ultrapure Water System (Millipore, США).

Минимальные подавляющие концентрации диклофенака в отношении культур родококков определяли методом серийных разведении. Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 346 отличался выраженной устойчивостью к диклофенаку (МПК ≥200 мг/л).

В экспериментах по биодеструкции диклофенака натрия применяли минеральную среду RS (г/л): K₂HPO₄ 2,0; KH₂PO₄ 2,0; KNO₃ 1,0; (NH₄)₂SO₄ 2,0; NaCl 1,0; MgSO₄ × 7H₂O 0,2; CaCl₂ × 2H₂O 0,02; FeCl₃ × 7H₂O 0,001 [http://www.iegmcol.ru/medium/med11.html]. При выборе исходной концентрации диклофенака учитывали большой объем его использования, интенсивность выброса в окружающую среду и персистентность в окружающей среде. При этом исходили из фактической концентрации диклофенака, детектируемого в водных и почвенных средах, а также из предположения о том, что большие дозы приносят негативные эффекты, но стимулируют защитные механизмы организма, тогда как малые дозы вызывают негативные эффекты, но не стимулируют защитные механизмы организма. Диклофенак использовали в концентрации 50 мг/л и 50 мкг/л в виде порошка или раствора в этаноле (1 мг/1 мл). До инокуляции исходное значение рН среды составляло 7,0. Клетки, предварительно выращенные в течение 2-х сут в бульоне LB (Sigma-Aldrich, США) и отмытые дважды фосфатным буфером (рН 7,0), вносили в среду культивирования до конечной концентрации 3,8×10⁸ кл/мл. Для экспериментов по биодеструкции родококки предварительно выращивали в присутствии низкой (5 мкг/л) концентрации диклофенака. В качестве косубстрата использовали D-глюкозу (0,5%). Процесс биодеструкции вели при температуре 28°С. Во избежание фотоинициированного окисления диклофенака содержимое колб защищали от действия света с помощью светонепроницаемого материала. Ввиду большой (более 60 сут) продолжительности лабораторных экспериментов во времени полученные значения корректировали с учетом поправки на испарение воды с помощью уравнений [Gauthier Н., Yargeau V., Cooper D.G. Biodegradation of pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus nigerby co-metabolism // Science of the Total Environment. 2010. V. 408. P. 1701-1706].

В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор диклофенака в минеральной среде (для оценки абиотической деструкции фармвещества); (2) стерильный раствор диклофенака в минеральной среде с инактивированными клетками родококков (для оценки степени адсорбции диклофенака на бактериальных клетках), при этом бактериальные клетки инактивировали автоклавированием при 1,0 атм. трехкратно; (3) минеральную среду, содержащую глюкозу с бактериальными клетками, без лекарственного вещества (контроль для разграничения метаболитов, появляющихся в результате разложения диклофенака).

Концентрацию диклофенака натрия регистрировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью хроматографа LC Prominence (Shimadzu, Япония), оборудованного колонкой с обращенно-фазовым сорбентом Phenomenex Jupiter® 5u C18 300 A, 250×4,60 mm 5 micron (Phenomenex, США) и диодноматричным детектором. Подвижная фаза: фосфатный буферный раствор (рН 3,5) - ацетонитрил в соотношении 60:40. Режим элюирования изократический, скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин, длина волны детектирования - 273 нм; объем вводимой пробы - 20 мкл; температура термостата колонки - 40°С. Время удерживания диклофенака 18,70±0,02 мин. Подготовку проб для данного анализа осуществляли посредством их центрифугирования в течение 5 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранный фильтр (Whatman, UK) с диаметром пор 0,20 мкм.

Процесс разложения диклофенака штаммом Rhodococcus ruber ИЭГМ 346в высокой концентрации (50 мг/л) протекал медленно, что свидетельствовало о высокой химической устойчивости молекулы исходного экофармполлютанта (Фиг. 1А): остаточное содержание фармпрепарата в постферментационной культуральной среде родококков на 60 сут составляло еще примерно 50%. Средняя скорость биодеградации диклофенака на протяжении эксперимента составляла 0,4 мг/сут. Максимальные (0,7 мг/сут) показатели скорости биодеградации наблюдались в первые 10 сут эксперимента. На 10 сут регистрировалось увеличение роста родококков и постепенное снижение концентрации диклофенака при условии дробного внесения глюкозы в качестве легко деструктируемого источника углерода. Измеряемая абиотическая деструкции диклофенака варьировала в пределах от 2 до 5%. В контрольном варианте с инактивированными клетками зафиксировано незначительное (до 10%) снижение исходной концентрации диклофенака, что свидетельствовало о возможной частичной сорбции вещества на поверхности бактериальных клеток.

Другая картина наблюдалась в случае использования диклофенака в низкой концентрации (50 мкг/л). В этом случае значительную убыль диклофенака регистрировали в первые 2 сут (Фиг. 1Б). При этом средняя скорость биодеструкции составляла 8,3 мкг/сут. На фоне достижения максимальной скорости биодеградации диклофенака (13 мкг/сут) происходил постепенный стабильный прирост клеточной биомассы. На 5-ые сут увеличение численности родококков сопровождалось значительной убылью диклофенака, полное разложение которого достигалось на 6 сут эксперимента.

Пример 2. Пути биодеструкции диклофенака натрия клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 346.

Состав продуктов разложения диклофенака анализировали методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на хроматографе Agilent 6890-5973N (Agilent Technologies, США), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. В качестве газа-носителя использовали гелий (1 мл/мин). Температура инжектора и интерфейса составляла 260 и 290°С, соответственно. Температура колонки программировалась от 130 до 300°С с повышением температуры со скоростью 10°С/мин. Ввод хлороформного экстракта в количестве 1 мкл осуществляли без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 40 до 500 m/z. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами библиотеки NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Version 1.7) For Use with Microsoft^® Windows™ Users' Guide. Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечными с коэффициентом подобия, превышающим 90%. Для выделения диклофенака и его возможных метаболитов среду ферментации подкисляли 10%-ным водным раствором HCl до рН 2,0 и трижды экстрагировали эквивалентным (10 мл) объемом хлороформа. Объединенные экстракты сушили над Na₂SO₄, растворитель удаляли на роторном испарителе (Heidolph, Германия).

По результатам ГХ-МС, бактериальная деградация диклофенака сопровождалась образованием метаболитов. На Фиг. 2 представлена схема разложения диклофенака натрия (соединение 1) клетками Rhodococcus ruber IEGM 346. В первые 5-10 сут инкубации родококков в присутствии высоких (50 мг/л) концентраций диклофенака (соединение 2) среди продуктов его биодеструкции детектировались первичные моногидроксиметаболиты - 2-[4'-гидрокси-2',6'-дихлорфенил]-амино)-фенилуксусная кислота (4'-ОН-диклофенак, соединение 3), 5-гидрокси-2-[2',6'-дихлорфенил]-амино)-фенилуксусная кислота (5-ОН-диклофенак, соединение 4), а также соединение 5 бензохинониминовой структуры и его дигидроксипроизводное (соединение 16). Позднее в среде инкубации обнаруживались моно- и дигидроксипроизводные 2,6-дихлоранилина (соединения 6 и 8), образующиеся в результате разрушения связи C-N у второго атома углерода в нехлорированном ароматическом кольце соединений 3 и 4; а также фенилуксусная кислота (соединение 7) и ее гидроксилированное производное - 3-гидроксифенилуксусная кислота (соединение 9).

При использовании более низкой (50 мкг/л) концентрации диклофенака вышеперечисленные продукты обнаруживались в первые 2 сут инкубации родококков. На 4-е сут в среде регистрировались метаболиты со спектроскопическими характеристиками гомогентизиновой (2,5-дигидроксифенилуксусной) кислоты, m/z=168 (соединение 10) и продукта ее окисления 2-(p-бензохинон-2)уксусной кислоты, m/z=166 (соединение 11), а также фумарилацетоуксусной кислоты, m/z=200 (соединение 12) и продуктов ее гидролиза - ацетоуксусной, m/z=102 и фумаровой кислот, m/z=116 (соединения 13, 14 соответственно). Кроме того, наблюдался интенсивный пик соединения 15 (m/z=214), которое, по-видимому, образовалось в результате реакции окисления соединения 12 по седьмому атому углерода за счет подвижности атомов водорода, находящихся между карбоксильной и кетонной группами. Диклофенак и вышеуказанные соединения к концу ферментации (на 6 сут эксперимента) не обнаруживались в среде инкубации родококков, что свидетельствовало о дальнейшем превращении метаболитов. В контрольных экспериментах метаболиты диклофенака не выявлялись.

Особо следует особо отметить два события: (1) разрыв связи C-N в структуре DCF с образованием фенилуксусной кислоты и (2) раскрытие хинонового цикла с образованием фумарилацетоуксусной кислоты и продуктов ее гидролиза - ацетоуксусной и фумаровой кислот, которые могут считаться продуктами, свидетельствующими о детоксикации диклофенака.

В процессе работы определены 16 метаболитов, продуцируемых R. ruber IEGM 346, 4 из которых (4'-ОН-диклофенак, 5-ОН-диклофенак и два соединения бензохинониминовой структуры) аналогичны таковым, полученным ранее при изучении метаболизма диклофенака (1,7 и 34,0 мкМ) у альфа-протеобактерий Labrys portucalensis F11 [Moreira S., Bessa V.S., Murgolo S., Piccirillo C., Mascolo G., Castro P.M.L. Biodegradation of diclofenac by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2018. V. 152. P. 104-113], и 2 метаболита (4'-OH-диклофенак и 5-ОН-диклофенак), полученные ранее с использованием грамположительных бактерий Actinoplanes [Osorio-Lozada A., Surapaneni S., Skiles G.L., Subramanian R. Biosynthesis of drug metabolites using microbes in hollow fiber cartridge reactors: case study of diclofenac metabolism by Actinoplanes species // Drug Metabolism and Disposition. 2008. V. 36. P. 234-240]. Однако во всех обнаруженных авторами метаболитах сохранялась связь C-N при втором атоме углерода в нехлорированном ароматическом кольце диклофенака. При этом отсутствовали сведения, подтверждающие факт раскрытия ароматического цикла в структуре образующихся соединений.

Таким образом, заявленный штамм Rhodococcus ruber IEGM 346, депонированный под номером ВКПМ АС-2106, может рассматриваться как эффективный биодеструктор токсичного экофармполлютанта диклофенака натрия.

Изобретение поясняется нижеследующими графическими материалами, на которых отображены:

на Фиг. 1. Динамика биодеградации 50 мг/л (А) и 50 мкг/л (Б) диклофенака натрия клетками Rhodococcus ruber IEGM 346 в присутствии глюкозы. контроль абиотической деструкции, контроль биосорбции, сухая биомасса родококков в присутствии диклофенака и глюкозы и сухая биомасса родококков в присутствии глюкозы. Стрелками обозначено довнесение (дробное внесение) глюкозы.

на Фиг. 2. Предположительные пути биодеструкции диклофенака натрия с использованием Rhodococcus ruber IEGM 346. 1 - натриевая соль 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусной кислоты; 2 - 2-[2-(2',6'-дихлорфениламино)фенил]уксусная кислота; 3 - (2-[4'-гидрокси-2',6'-дихлорфенил]амино)фенилуксусная кислота; 4 - (5-гидрокси-2-[2',6'-дихлорфенил]амино)фенилуксусная кислота; 5 - 2-(1-(5-оксо-циклогекса-1,3-диенил-2-(2',6'-дихлор-фенилимино)уксусная кислота; 6 - 4-амино-3,5-дихлорфенол; 7 - фенилуксусная кислота; 8 - 5-амино-4,6-дихлорбензол-1,2-диол; 9 - 3-гидроксифенилуксусная кислота; 10 - 2,5-дигидрокси-фенилуксусная кислота (гомогентизиновая кислота); 11 - 2-(р-бензохинон-2)-уксусная кислота; 12 - фумарилацетоуксусная кислота; 13 - ацетоуксусная кислота; 14 - фумаровая кислота; 15 - 4,6,7-триоксоокт-2-ендиовая кислота; 16 - 2-[1-(5-оксициклогекса-1,3-диенил-2-(3',4'-дигидрокси-2',6'-дихлорфенил)имино]уксусная кислота.