Результат интеллектуальной деятельности: Тест система для пренатального генетического тестирования на HLA-совместимость

В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическое тестирование на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом не только для профилактики таких заболеваний, но и для лечения некоторых наследственных заболеваний. Такие заболевания как, например, предполагают возможность лечения пробанда с помощью трансплантации костного мозга или кроветворных клеток пуповинной крови. В таком случае с помощью ПГТ можно родить не только здорового ребенка, но идеального донора для больного ребенка в семье с помощью отбора по HLA-совместимости.

Основной проблемой при генетическом тестировании эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации материала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких мутаций для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации или деградации образца.

ПГТ на HLA-совместимость (Human Leukocyte Antigens - Человеческие лейкоцитарные антигены) рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с необходимостью получения здорового ребенка, который может быть совместимым донором для больного ребенка в этой семье. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО, такие, которые не несут мутацию, являющуюся причиной заболевания, и максимально совместимы по HLA с пробандом.

В соответствии с рекомендациями Консорциума Пренетальной Генетической Диагностики Европейского Общества Репродукции и Эмбриологии Человека (ESHRE PGD consortium) для косвенного HLA-типирования необходимо выбрать минимальный набор маркеров: 1 маркер, локализованный выше HLA-A, 1 между HLA-A и HLA-B, 1 между HLA-B и HLA-DRA, 1 между HLA-DRA и HLA-DQB1 и 1 ниже HLA-DQB1; увеличение количества маркеров в 2 раза для каждой позиции значительно повышает эффективность теста. При этом примерно у 2% эмбрионов наблюдается рекомбинация в районе локуса HLA, что также усложняет тестирование. Важно понимать, что указанные цифры - это информативные маркеры, однако до составления родословной для конкретной семьи невозможно предсказать, сколько и какие маркеры будут информативными в каждом случае, поэтому при разработке тест-системы необходимо выбрать еще больше маркеров с высокой степенью гетерозиготности. Именно в этом состоит основная сложность создания тест-системы для косвенного HLA-типирования. К ней необходимо добавить особенности генетического тестирования в условиях ПГТ, описанные выше. Именно решение этих задач является главным достижением разработанного способа преимплатационного генетического тестирования на HLA-типирование.

Разработка тест-системы

Совместимость по HLA определяется с помощью косвенных маркеров, сцепленных с аллелями одной из родительских хромосом. Анализ наследования молекулярно-генетических маркеров позволяет выявить группы сцепления, которые унаследовал пробанд от родителей. Для этого на протяжении всего локуса HLA были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeats - короткие тандемные повторы), с гетерозиготностью не менее 0,75. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу полугнездовой ПЦР, позволяющей повысить точность и эффективность анализа. В тест-систему были включены 46 STR локусов: A1-D6S276, A2-D6S291, A3-D6S273, A4-D6S265, B1-TNFa, B2-TNFb, B3-D6S2447, B4-D6S510, C1-D6S62, C2-D6S2671, C3-LH-1, C4-D6S2749, D1-D6S2972, D2-D6S2883, D3-D6S306, D4-D6S2780, E1-D6S2810, E2-D6S2811, Е3-D6S248, E4-D6S1624, F1-D6S1666, F2-D6S1645, F3-HLAC-CA, F4-D6S2971, G1-D6S258, G2-D6S1560, G3-D6S1629, G4-D6S2443, H1-D6S1568, H2-D6S2444, Н3-D6S1683, H4-D6S299, I1-D6S497, I2-D6S388, I3-D6S426, I4-D6S1611, I5-D6S2747, J1-D6S439, J2-D6S2876, J3-MICA, J4-D6S2669, K1-D6S1583, K2-D6S105, K3-D6S2414, K4-D6S2874, K5-MOGe. Праймеры для амплификации соответственно указаны в перечне последовательностей. Все локусы находятся на 6 хромосоме в районе координат 23925636-40642183 (в соответствии с hg19 (человеческий геном-hg)). Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешним праймером не должна превышать 500 п. н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренним праймером от 120 до 300 п. н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 0,5°С.

Отработка тест-системы для ПГТ

На этапе отработки тест-системы проводится подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих этапах, универсальность тест-системы для биообразцов различного типа. При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 этапа полугнездовой ПЦР) с концентрацией 10mM каждого праймера в растворе. Так как в рамках тестированияи клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton Х-100, 1 мкг Proteinase K), два или три образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной. В рамках полугнездовой ПЦР (seminested-PCR) амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. Во втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами. Полугнездовая ПЦР Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа на приборе ABI3130XL. ПЦР-смесь для первого этапа амплификации содержала 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mM каждого деоксинуклеотида, 0.15 μM каждого праймера, 2,5 U/μ1 of HsTaq ДНК-полимераза (Евроген, Россия), 6% of DMSO and 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус. В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×PCR Buffer with Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ Loading Buffer (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μM каждого праймера, 1U/μ1 of HsTaq DNA-polymerase (Евроген, Россия), 6% of DMSO and 1 μ1 ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации с ДНК членов семьи). Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные маркеры для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клиническом тестировании.

ПГТ на HLA-совместимость с помощью разработанной тест-системы (Применение на практике)

Пример 1

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой для ребенка, страдающего анемией Фанкони, необходим HLA-совместимый донор для трансплантации костного мозга, а родители являются носителями мутаций в гене FANCA. Им было рекомендовано проведение ПГТ на моногенное заболевание Анемия Фанкони и на HLA-совместимость в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание и совместимых по HLA с больным ребенком. Описание процедуры ПГТ моногенного заболевания не относится к сфере интересов данного раздела, а потому будет описан только результат этого анализа для эмбрионов и дальнейшая процедура HLA-типирования.

Разработка родословной

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) супругов и ребенка с заболеванием для выявления групп сцепления полиморфных маркеров. Было проанализировано 46 STR локусов. Из них 28 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам: партнер пациентки - A1 D6S 276 - 202/ 217, А2 D6S 291 - 159/ 161, A3 D6S 273 - 146/ 144, А4 D6S 265 - 120/ 118, B1 TNFa - 118/118, В3 D6S 2447 - 205/ 183, В4 D6S 510 -161/ 142, C1 D6S 62 - 165/ 165, С2 D6S 2671 - 107/ 114, С3 LH-1 - 129/ 144, D1 D6S 2972 - 219/ 222, D2 D6S 2883 - 136/ 132, D3 D6S 306 - 152/ 158, D4 D6S 2780 - 86/ 86, E1 D6S 2810 - 179/ 168, G2 D6S 1560 - 151/ 133, G3 D6S 1629 - 155/ 159, G4 D6S 2443 - 185/ 195, H1 D6S 1568 - 122/ 122, Н2 D6S 2444 - 145/ 138, I2 D6S 388 - 151/ 153, I4 D6S 1611 - 189/ 183, I5 D6S 2747 - 205/201, J3 MICA - 174/ 174, J4 D6S 2669 - 202/ 204, K1 D6S 1583 - 133/ 133, K3 D6S 2414 - 177/ 181, K4 D6S2874 - 199/ 201, пациентка - A1 D6S 276 - 217/ 208, А2 D6S 291 - 161/ 165, A3 D6S 273 - 144/ 146, А4 D6S 265 - 118/ 118, B1 TNFa - 102/ 108, В3 D6S 2447 - 205/ 195, В4 D6S 510 - 150/ 142, C1 D6S 62 - 149/ 156, С2 D6S 2671 - 114/ 107, С3 LH-1 - 146/ 146, D1 D6S 2972 - 211/ 234, D2 D6S 2883 - 134/ 136, D3 D6S 306 - 152/ 152, D4 D6S 2780 - 86/ 90, Е1 D6S 2810 - 181/ 181, G2 D6S 1560 - 151/ 137, G3 D6S 1629 - 140/ 153, G4 D6S 2443 -195/ 185, H1 D6S 1568 - 122/ 128, Н2 D6S 2444 - 138/ 136, I2 D6S 388 - 153/ 151, I4 D6S 1611 - 174/ 191, I5 D6S 2747 - 201/ 205, J3 MICA - 183/171, J4 D6S 2669 - 204/ 204, K1 D6S 1583 - 148/ 139, K3 D6S 2414 - 181/ 177, K4 D6S2874 - 199/ 199, ребенок с заболеванием - A1 D6S 276 - 202/ 208, А2 D6S 291 - 159/ 165, A3 D6S 273 - 146/ 146, А4 D6S 265 - 120/ 118, B1 TNFa - 118/ 108, В3 D6S 2447 - 205/ 195, В4 D6S 510 -161/ 142, C1 D6S 62 - 165/ 156, С2 D6S 2671 - 107/ 107, С3 LH-1 - 129/ 146, D1 D6S 2972 - 219/ 234, D2 D6S 2883 - 136/ 136, D3 D6S 306 - 152/ 152, D4 D6S 2780 - 86/ 90, E1 D6S 2810 - 179/ 181, G2 D6S 1560 - 151/ 137, G3 D6S 1629 - 155/ 153, G4 D6S 2443 - 185/ 185, H1 D6S 1568 - 122/ 128, Н2 D6S 2444 - 145/ 136, I2 -D6S 388 - 151/ 151, I4 D6S 1611 - 189/ 191, I5 D6S 2747 - 205/ 205, J3 MICA - 174/ 171, J4 D6S 2669 - 202/ 204, K1 D6S 1583 - 133/ 139, K3 D6S 2414 - 177/ 177, K4 D6S2874 - 199/ 199.

ПГТ

В цикле ЭКО было получено 4 эмбриона, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% PVP (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию Генетико. Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали в 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции мутации и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. 2 этап проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были выявлены группы сцепления, унаследованные эмбрионами. Полученные результаты: T1 - A1 D6S 276 - 217, А2 D6S 291 - 161, A3 D6S 273 - 144, A4 D6S 265 - 118, B1 TNFa - 118/ 102, В3 D6S 2447 - 183/205, В4 D6S 510 - 142/ 150, C1 D6S 62 - 165/ 149, С2 D6S 2671 - 114, С3 LH-1 - 144/ 146, D1 D6S 2972 - 222/ 211, D2 D6S 2883 - 132/ 134, D3 D6S 306 - 158/ 152, D4 D6S 2780 - 86, Е1 D6S 2810 - 168/ 181, G2 D6S 1560 - 133/ 151, G3 D6S 1629 - 159/ 140, G4 D6S 2443 -FA, H1 D6S 1568 - 122/ 109, Н2 D6S 2444 - 138, I2 D6S 388 - 153, I4 D6S 1611 - 183/ 174, I5 D6S 2747 - 201, J3 MICA - 174/ ADO, J4 D6S 2669 - 202/ 204, K1 D6S 1583 -133/ 148, K3 D6S 2414 - 181, K4 D6S2874 - 201/ 199, Т2 - A1 D6S 276 - 202/ 208, А2 D6S 291 - 159/ 165, A3 D6S 273 - 146, А4 D6S 265 - 120/ 118, B1 TNFa - 118/108, В3 D6S 2447 - 205/ 195, B4 D6S 510 - 165/ 142, C1 D6S 62 - 165/ ADO, C2 D6S 2671 - 107, С3 LH-1 - 129/ 146, D1 D6S 2972 - 219/ 234, D2 D6S 2883 - 136, D3 D6S 306 -152, D4 D6S 2780 - 86/ 90, E1 D6S 2810 - 179/ 181, G2 D6S 1560 - 151/ 137, G3 D6S 1629 - ADO/ 153, G4 D6S 2443 - 185, H1 D6S 1568 - 122/ 128, H2 D6S 2444 - 145/ 136, I2 D6S 388 - 151, I4 D6S 1611 - 189/191, I5 D6S 2747 - FA, J3 MICA - 174/ADO, J4 D6S 2669 - ADO/ 204, K1 D6S 1583 - 133/ 139, K3 D6S 2414 - 177, K4 D6S2874 - 199, T3 - A1 D6S 276 - 217, A2 D6S 291 - 161, A3 D6S 273 - 144, A4 D6S 265 - 118, B1 TNFa - 118/ 102, B3 D6S 2447 - 183/ 205, B4 D6S 510 - 142/ 150, C1 D6S 62 - 165/ 149, C2 D6S 2671 - 114, C3 LH-1 - 144/ 146, D1 D6S 2972 - 222/ 211, D2 D6S 2883 - 132/ 134, D3 D6S 306 - 158/ 152, D4 D6S 2780 - 86, E1 D6S 2810 - 168/ 181, G2 D6S 1560 -133/ 151, G3 D6S 1629 - 159/ 140, G4 D6S 2443 - 195, H1 D6S 1568 - 122, H2 D6S 2444 - 138, I2 D6S 388 - 153, I4 D6S 1611 - 183/ 174, I5 D6S 2747 - 201, J3 MICA -ADO/ 183, J4 D6S 2669 - 204, K1 D6S 1583 - 133/ 148, K3 D6S 2414 - 181, K4 D6S2874 - 201/ 199, T4 - A1 D6S 276 -, A2 D6S 291 -, A3 D6S 273 -, A4 D6S 265 -, B1 TNFa -, B3 D6S 2447 -, B4 D6S 510 -, C1 D6S 62 -, C2 D6S 2671 -, C3 LH-1 -, D1 D6S 2972 -, D2 D6S 2883 -, D3 D6S 306 -, D4 D6S 2780 -, E1 D6S 2810 -, G2 D6S 1560 -, G3 D6S 1629 -, G4 D6S 2443 -, H1 D6S 1568 -, H2 D6S 2444 -, I2 D6S 388 -, I4 D6S 1611 -, I5 D6S 2747 -, J3 MICA -, J4 D6S 2669 -, K1 D6S 1583 -, K3 D6S 2414 -, K4 D6S2874 -, T4 - унаследовано заболевание Анемия Фанкони, HLA-типирование не проводилось.

По результатам тестирования 1 эмбрион оказался нормой по мутациям в гене FANCA, 2 эмбриона - гетерозиготой по одной из мутаций и 1 эмбрион унаследовал заболевание. Поэтому HLA-типирование проводилось только для 3 эмбрионов. Из них только 1 (гетерозиготный носитель мутации) оказался гистосовместим с больным ребенком. Для этого эмбриона также провели преимплантационный генетический скрининг (ПГС) хромосомных аномалий, который не выявил нарушений. Этот эмбрион был рекомендован к переносу. 2 оставшихся эмбриона, не унаследовавших заболевание, но не подходящих по HLA, было решено оставить на хранение с возможностью проведения ПГС и переноса.

Пример 2

В ЦГРМ Генетико обратилась семья К, в которой для ребенка, страдающего буллезным эпидермолизом, необходим HLA-совместимый донор для трансплантации фибробластов, а родители являются носителями мутаций в гене COL7A1. Им было рекомендовано проведение ПГТ на моногенное заболевание Буллезный эпидермолиз и на HLA-совместимость в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание и совместимых по HLA с больным ребенком. Описание процедуры ПГТ моногенного заболевания не относится к сфере интересов данного раздела, а потому будет описан только результат этого анализа для эмбрионов и дальнейшая процедура HLA-типирования.

Разработка родословной

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) супругов и ребенка с заболеванием для выявления групп сцепления полиморфных маркеров. Было проанализировано 37 STR локусов. Из них 35 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры. Полученные результаты по информативным маркерам представлены в таблице 1.

ПГТ

В цикле ЭКО было получено 11 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1×PBS (Invitrogen, США), 1% PVP (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию Генетико. Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (Illumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали в 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции мутации и праймерами для информативных для семьи К полиморфных маркеров в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. 2 этап проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были выявлены группы сцепления, унаследованные эмбрионами. Из 11 эмбрионов 4 унаследовали заболевание, HLA типирование проводилось для 7 эмбрионов на 15 маркеров. Полученные результаты представлены в таблице 2.

По результатам тестирования 1 эмбрион оказался нормой по мутации в гене COL7A1, 6 эмбрионов - гетерозиготой по мутации и 4 эмбриона унаследовали заболевание. Поэтому HLA-типирование проводилось для 7 эмбрионов. Из них только 2 (гетерозиготные носители мутации) оказались гистосовместимы с больным ребенком. Для этих эмбрионов также провели преимплантационный генетический скрининг (ПГС) хромосомных аномалий, который не выявил нарушений. Эти эмбрионы были рекомендованы к переносу. 5 оставшихся эмбрионов, не унаследовавших заболевание, но не подходящих по HLA, было решено оставить на хранение с возможностью проведения ПГС и переноса.

--->

Перечень последовательностей праймеров

A1-D6S276 –

Внешние - Fout 5'-GTGTACACATCAATCAAATCATC-3', Rout 5'-CCTCTTCAGTAGTTTTGCTACAG-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-TCAATCAAATCATCCCCAGAAG-3', rin 5'-GGGTGCAACTTGTTCCTCCT-3';

A2-D6S291 –

Внешние - Fout 5'-CTCAGAGGATGCCATGTCTAAAATA-3', Rout 5'-GGGGATGACGAATTATTCACTAACT-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-GTCTAAAATATCCATCCGGCAT-3', rin 5'-TTAATTGTGGTGATGGTTTCAC-3';

A3-D6S273 –

Внешние - Fout 5'-ATGTAAGATGTTAGCATTAGGAGA-3', Rout 5'-AGTTAAAACCAAACTTCAAATTT-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-TGAGTATTTCTGCAACTTTTCTGTC-3', rin 5'-AAACCAAACTTCAAATTTTCGG-3';

A4-D6S265 –

Внешние - Fout 5'-CCTTCTATCTGACTGTACGTTCGT-3', Rout 5'-AGCTTTAAAAGGTTGATCTAATCG-3',

Внутренние-fin 5'-(6-FAM)-TCGTACCCATTAACCTACCTCTCT-3', rin 5'-TCGAGGTAAACAGCAGAAAGATAG-3';

B1-TNFa –

Внешние - Fout 5'-ATGCAAGAAGGGTAAAGCCTCTAG-3', Rout 5'-TTTTGAGGTTGCAGTGGGCTAT-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-GCCTCTAGATTTCATCCAGCCAC-3', rin 5'-CCTCTCTCCCCTGCAACACA-3';

B2-TNFb –

Внешние - Fout 5'-ATGCAAGAAGGGTAAAGCCTCTAG-3', Rout 5'-TTTTGAGGTTGCAGTGGGCTAT-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-TGTGTTGCAGGGGAGAGAGG-3', rin 5'-GGCCACAGAGCAAGACACCA-3';

B3-D6S2447 –

Внешние - Fout 5'-CCATGGTCACTGTTTATCTGCA-3', Rout 5'-GGACAATGTGTTTGAGAGGTGTG-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-CTGCATTTCTCTTCCTTATCACTTC-3', rin 5'-TTTGAGAGGTGTGCATGTTACC-3';

B4-D6S510 –

Внешние - Fout 5'-AACACACTGATTTCCATAGCAGGT-3', Rout 5'-CTGCAATGGGCTACTACTTCACA-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-TTTGTCTTTCCCAATGTACTACAC-3', rin 5'-GCTACTACTTCACACCAATTAGGA-3';

C1-D6S62 –

Внешние - Fout 5'-GCAAGAAGGGTAAAGCCTCTAGA-3', Rout 5'-GCAAGACACCATGTCAAAAGAA-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-GATTTCATCCAGCCACAGGA-3', rin 5'-TCCAATCACCTCTGCTCACC-3';

C2-D6S2671 –

Внешние - Fout 5'-ATTACAAGGGCTTTAGGAGGTCTG-3', Rout 5'-AGGTCAAAGCTGCAGTAGCCAT-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-GAGCCAGGATGGAGACCAAA-3', rin 5'-CCTGGATAACAGAACGAGACCC-3';

C3-LH-1 –

Внешние - Fout 5'-GAACAGAGACAATGCCTAGAACC-3', Rout 5'-ACCTTACTGGGCACAAATTCAC-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-GCTAGTCTGTGCCAAGGAACTC-3';

C4-D6S2749 –

Внешние - Fout 5'-GCATACACTCTGAAGCAGCC-3', Rout 5'-GAGGTAATGTCACAGGATGGG-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-GAAATGTTAGGTCAGAACCACAGA-3', rin 5'-GATGGGAAGTTTCCAGAGTG-3';

D1-D6S2972 –

Внешние - Fout 5'-ACCAGGCTAGGATCTGTCACA-3', Rout 5'-TTGACCATGGGTAACTGAAGC-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-5'-AGATCACCTCGAGTGAGTCTCTT-3';

D2-D6S2883 –

Внешние - Fout 5'-ACTTTCCTAATTCTCCTCCTTC-3', Rout 5'-CATCCATGTAAAACAGAGACC-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-GCATGAGTAAACTATGGAATCTC-3';

D3-D6S306 –

Внешние - Fout 5'-CCTTCCAATTCACCAAAAATTG-3', Rout 5'-GGTTTGAGAGTTTCAGTGAGCC-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-AAGGTTTGTCAAACATCCCATC-3';

D4-D6S2780 –

Внешние - Fout 5'-GTCAGGAGAATTGCTTGAACCC-3', Rout 5'-ATTCCTCTGCTCTCTGGGATTG-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-TGGGTAACAGAGCAAGACTCTGT-3', rin 5'-TGGGATTGCAGATGTGTTACAC-3';

E1-D6S2810 –

Внешние - Fout 5'-ATCCTGCCTCAGAATTAGAACATC-3', Rout 5'-TCTAGAACCACTCTTCGTACCACA-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-CGTTTTCAGCCTGCTAGCTTAT-3', rin 5'-CCACAGTCTCTATCAGTCCAGATTC-3';

E2-D6S2811 –

Внешние - Fout 5'-GTCAAGCATATCTGCCATTTGG-3', Rout 5'-GCCCAGTAGTAAGCCAGAAGCTA-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-ACTTGGGCAATGAGTCCTATGA-3';

E3-D6S248 –

Внешние - Fout 5'-GGCAGGAGAATGGCATGAAC-3', Rout 5'-TTGATCAGGAATGGTGAGAAGG-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-CGAGATCAAGCCACTGCACT-3', rin 5'-CAGGAATGGTGAGAAGGGAAA-3';

E4-D6S1624 –

Внешние - Fout 5'-CCCCAGAGGCCTATATATAACCC-3', Rout 5'-CGTCCTATCAGTTAACACTTCATGG-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-TATAACCCCAGGTGTTTGTGG-3', rin 5'-GGAAGTCTTCAGTGGAGAGAGTG-3';

F1-D6S1666 –

Внешние - Fout 5'-GTGCTGCTTGAGGAAGGAGTCT-3', Rout 5'-ACCCAGCATTTTGGAGTTGTGT-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-GTTGGGCAGCATTTGTAGATTTC-3';

F2-D6S1645 –

Внешние - Fout 5'-CTGAGATTGCACCACTGTACTCC-3', Rout 5'-CCCACTTAGCAGACAGAGAGATAGA-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-ACAGAGTGAGACTCTGTCGCAAAC-3';

F3-HLAC-CA –

Внешние - Fout 5'-ACCCGTCAAACCTTGACTGTTC-3', Rout 5'-GTAGCTGGGATTACAGGTGCCT-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-CGGCAAGAGACTCTGATGAGAAc-3';

F4-D6S2971 –

Внешние - Fout 5'-CTGTCCTATTTCATATGCTCAGGTA-3', Rout 5'-GACAATGAACTTGTCCTGAGAATG-3',

Внутренние - rin 5'-(6-FAM)-TTGTCCTGAGAATGAAGGTCTAGA-3';

G1-D6S258 –

Внешние - Fout 5'-GCAAATCAAGAATGTAATTCCC-3', Rout 5'-GGTTTTTCCATTTGTTTGTGTC-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-GCTTTGTAGTTCTTTTTGTGGA-3';

G2-D6S1560 –

Внешние - Fout 5'-TCCTTGGTGGTAGTGTTTCTAA-3', Rout 5'-ATGGACATTGTGACTCTGAGTC-3',

Внутренние - rin 5'-(6-FAM)-TGAGTCAAGTGAGAAACAGAGAG-3';

G3-D6S1629 –

Внешние - Fout 5'-CGTTGCTGAACCCATAGTGG-3', Rout 5'-GGCTCCCCAATTATCTCTGC-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-CACAGTGACTTGTACTGAAAGCTCA-3';

G4-D6S2443 –

Внешние - Fout 5'-CCATACCAAAGTAAAACCCAGTG-3', Rout 5'-GACTTGTTTTGGTTTGGTTTCC-3',

Внутренние - rin 5'-(6-FAM)-CATTTGATACTGAGGATGAAGGG-3';

H1-D6S1568 –

Внешние - Fout 5'-GCCCAGTCTACAGATATCCCCA-3', Rout 5'-AGCTAGGCCAGGCCGTGT-3',

Внутренние -fin 5'-(6-FAM)-AGATATCCCCACCAAGGCAG-3';

H2-D6S2444 –

Внешние - Fout 5'-GGGAGCATTTGTGTATTTCTGTATG-3', Rout 5'-GTGCTAAGAACTTTTCTGCAATAGG-3',

Внутренние -rin 5'-(HEX)-AATGATTCATGAGCCAAGAACC-3';

H3-D6S1683 –

Внешние - Fout 5'-CTAGATGACAGGTTGATAGGTG-3', Rout 5'-AAGTAGAGACAGGATTTCTTGT-3',

Внутренние -fin 5'-(6-FAM)-ACATGTATCCGAGAACTTAAAGT-3';

H4-D6S299 –

Внешние -Fout 5'-GACTCTCCAGGGCAACAGTTCT-3', Rout 5'-ATGTCTCTCTTCTCTCCCTCCC-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-CCATGCAGTAACTCAGATCTAGGA-3';

I1-D6S497 –

Внешние -Fout 5'-TGCCTGTAATCCCAACTACTTG-3', Rout 5'-TTGGCTGTTGAATTGTGAGAGT-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-CCTGGGCAACAAGAGTGAAAC-3';

I2-D6S388 –

Внешние - Fout 5'-ACCAGCCAGCATCATATAACTA-3', Rout 5'-GGTTAGACGTAGCTTAAGAGAGAAT-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-GCTGATGGAGAATGAAATATGG-3';

I3-D6S426 –

Внешние - Fout 5'-CATGTGCTCTGCACCATAAGTG-3', Rout 5'-GGAACCAGAAACTGTGGCATAG-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-ACTCCCCCAAAAATGTAGTCAT-3', rin 5'-AAAATGCACGTACCTAGTCCTC-3';

I4-D6S1611 –

Внешние - Fout 5'-GGATTTCTTGCAAAACAAACCC-3', Rout 5'-TCCCTGCACCTAAGTTCTCTGA-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-AAGGGCTGAGTTTCTTCTTGGG-3';

I5-D6S2747 –

Внешние - Fout 5'-GGTGACATACATCAACTTGTGAGTT-3', Rout 5'-CTCTAGCAAAAGGAAGAGCCTAG-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-AGGAATCTAGTGCTCTCTCCTTT-3';

J1-D6S439 –

Внешние - Fout 5'-GGCTTCACAACTTTGGCACTAC-3', Rout 5'-CAGCCTCAGGGAAGACACATT-3',

Внутренние - fin 5'-(HEX)-CCCCTATTCTCCACCCACTAGA-3';

J2-D6S2876 –

Внешние - Fout 5'-AGACAGCTCTTCTTAACCTGCC-3', Rout 5'-GGTAAAATTCCTGACTGGCCT-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-GGAAAAGAGCTCACGCACAT-3', rin 5'-CCTGCCATCATGACTTCAAG-3';

J3-MICA –

Внешние - Fout 5'-CTCTGCCCAGTGTATAACAAGTCC-3', Rout 5'-GGGCCTTACCATCTCCAGAAAC-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-GAAAGTGCTGGTGCTTCAGAGTC-3', rin 5'-CTTACCATCTCCAGAAACTGCC-3';

J4-D6S2669 –

Внешние - Fout 5'-CATCCATGACAGAAAGCAGAGC-3', Rout 5'-GATGTGTGACCTTTTGGCACAG-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-CCTGCCTTCTGTAAGCCTCAG-3';

K1-D6S1583 –

Внешние - Fout 5'-CCCTAACCTGCTTCTACTGATCA-3', Rout 5'-AAGGGTGTTACCACTTAGGTCCT-3',

Внутренние - rin 5'-(6-FAM)-CTCAGGGACAGACAACCTCTG-3';

K2-D6S105 –

Внешние - Fout 5'-AACAAGAGCAAAACTCCGTCTC-3', Rout 5'-CTGATCACCCTCGATATTTTACC-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-TCACCTTGATATCTTATTACCCTGG-3';

K3-D6S2414 –

Внешние - Fout 5'-AACTGGGCTGAGATGTACCACT-3', Rout 5'-TGGTTGCTTTTCCTTCAGAGTA-3',

Внутренние - rin 5'-(6-FAM)-GACTCAAGGAGAGGAATGTGTG-3';

K4-D6S2874 –

Внешние - Fout 5'-CTGTTCATATCCTCATACATCTGCT-3', Rout 5'-GTTTTTCTTAAGGTAAGGAGGACAA-3',

Внутренние - fin 5'-(6-FAM)-TCATACATCTGCTTTGATCTCCC-3', rin 5'-GGACAATATTTTGCTCCTGAGG-3';

K5-MOGe –

Внешние - Fout 5'-GTGGGCACCTATAATACCAGCTAC-3', Rout 5'-GCGTGGATAAGGAAGGAAATACA-3',

Внутренние - rin 5'-(HEX)-GGGTTAGAAGTGTGCTTATGAA-3'

<---