Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ, ДНК-МИКРОЧИП, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, КОМПЛЕКТ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к молекулярно-генетическим исследованиям человека для диагностики наследственных заболеваний, предрасположенности к мультифакторным заболеваниям, имеющим генетическую составляющую, и персональной генетически-детерминированной реакции на фармацевтические препараты.

Приблизительно половина всех случаев наследования болезней происходит, когда мать и отец не страдают наследственными заболеваниями, однако являются скрытыми носителями поврежденных генов. Если ребенок наследует от каждого родителя такой поврежденный ген, это приведет к развитию болезни. Риск рождения больного ребенка у родителей-носителей составляет 25%, что с медико-генетической точки зрения характеризуется как высокий. Руководствуясь информацией о собственных генетических особенностях, полученной с помощью молекулярно-генетических исследований, а также используя современные возможности репродуктивной медицины, будущие родители смогут избежать рисков зачатия ребенка, больного тяжелым или смертельным наследственным заболеванием, и родить здорового ребенка.

Описание уровня техники

Известен способ скрининга новорожденных на такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, врожденный гипотиреоз, галактоземия, фенилкетонурия за один анализ крови. Присутствие или отсутствие мутаций ДНК определяют с помощью гибридизации полученных фрагментов на специализированном олигонуклеотидном биочипе. Для этого используют амплификацию PAH, CFTR, PAX8, GALT генов и получение одноцепочного флюоресцентно меченного продукта методом ник-трансляции и рестрикции, приготавливают биочип для скрининга новорожденных на заболевания, содержащий набор иммобилизованных определенных олигонуклеотидов. Интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Несмотря на то что такое исследование позволяет получить новый ускоренный метод массового скрининга новорожденных на наличие предрасположенности к моногенным заболеваниям, он обладает ограниченной информативностью.

Известен принцип отбора полиморфизмов, описанный в EP 2463384. Однако авторами изучались и отбирались полиморфизмы, определяющие возникновение внезапной сердечной смерти без учета их территориальной распространенности.

Описание сущности изобретений

Задачей настоящей разработки является создание метода исследования ДНК человека на наличие большого количества мутаций и/или полиморфизмов с использованием биочипа.

Еще одна задача состоит в разработке и применении уникального набора олигонуклеотидных зондов, позволяющих определять мутации и/или полиморфизмы, включенного в диагностикум (биочип), который может быть использован для диагностики наиболее часто встречающихся мутаций и полиморфизмов, ассоциированных с наиболее частыми для популяций людей (этнических групп), населяющих определенную географическую территорию, наследственными и мультифакторными заболеваниями с наследственной составляющей.

Основной отличительной особенностью микрочипа является первый этап его разработки - определение мутаций и/или полиморфизмов, которые могут быть выявлены с его помощью. На данном этапе, исходят из генетических особенностей популяций, населяющих определенную территорию: в диагностикум (микрочип) входят только наиболее частые мутации и/или полиморфизмы, ассоциированные с наиболее частыми на данной территории наследственными и мультифакторными заболеваниями с наследственной составляющей. Таким образом, эффективность и информативность диагностики на конкретной территории с помощью такого диагностикума увеличивается по сравнению с прямыми аналогами, за счет способа подбора выявляемых мутаций, а не за счет увеличения их количества.

Состав мутаций, выявляемых с помощью микрочипа, оптимизирован и строго специфичен для этнических групп, населяющих заданную территорию на протяжении долгого времени. Таким образом, эффективность и информативность генетической диагностики наследственных заболеваний с применением данного набора гораздо выше, чем с применением имеющихся аналогов.

Под частотой встречаемости мутации или полиморфизма подразумевается ее распространенность в заданной популяции или у заданных этнических групп из расчета количества случаев ее гомозиготного носительства на 1000 человек. При этом под общемировой частотой подразумевается ее усредненная частота среди изученных популяций планеты. Данные об общемировых частотах встречаемости мутаций и/или полиморфизмов и частотах встречаемости в заданной популяции получаются из научной литературы.

В одном аспекте изобретение относится к набору олигонуклеотидных зондов, позволяющему детектировать комплекс (набор) мутаций и/или полиморфизмов для молекулярно-генетического исследования (скрининга) человека, при этом:

(a) не менее 10% (от 10% до 95%) от общего количества мутаций и/или полиморфизмов, которые могут быть определены, должно иметь частоту встречаемости у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции людей, превышающую в среднем общемировую встречаемость не менее чем в два раза (соотношение частоты встречаемости у населения, проживающего на выбранной территории, или в выбранной популяции к среднемировой частоте составляет >2);

(b) нe менее 5% (от 5% до 90%) мутаций и/или полиморфизмов не должны встречаться у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции людей, отличных от выбранной;

(c) не более 10% (от 0% до 10%) мутаций и/или полиморфизмов, имеющих среднемировую частоту встречаемости, более чем в два раза превышающую частоту встречаемости у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции людей (соотношение среднемировой частоты к частоте встречаемости у населения, проживающего на выбранной территории, или в выбранной популяции >2);

(d) не более 5% (от 0% до 5%) мутаций и/или полиморфизмов, не встречающихся у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции;

(e) остальное содержание (от 0-85%) мутаций и/или полиморфизмов, встречающихся у этнических групп, проживающих на выбранной территории, или в выбранной популяции может быть равно в среднем общемировой или не может превышать ее более чем в два раза (соотношение частоты встречаемости у населения, проживающего на выбранной территории, или в выбранной популяции к среднемировой частоте составляет ≤2).

В ходе исследований было установлено, что именно с отбором исследуемых мутаций связана эффективность и информативность диагностики на конкретной территории, которые увеличиваются за счет того, что для диагностики взяты самые распространенные и специфичные для этой территории мутации.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения ДНК-микрочипа.

ДНК-микрочипы получают методом печати олигонуклеотидных зондов, содержащих участки ДНК, позволяющие детектировать выбранные мутации и/или полиморфизмы на стеклянной пластине, покрытой аминосиланом (см. WO 2004073988).

Отличительной особенностью разработанного нами способа является этап предварительного отбора мутаций по установленному нами алгоритму. Способ позволяет получить уникальный микрочип для молекулярно-генетической диагностики человека, принадлежащего к этнической группе, проживающей на определенной географической территории в течение долгого времени, и повысить точность и информативность исследования.

Способ получения ДНК-микрочипа для молекулярно-генетического исследования человека, проживающего на выбранной территории или в выбранной популяции, включает:

I) отбор мутаций и/или полиморфизмов, предусматривающий:

(a) отбор не менее 10% (от 10% до 95%) от общего количества мутаций и/или полиморфизмов, которые могут быть определены, имеющих частоту встречаемости у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции людей, превышающую в среднем общемировую встречаемость не менее чем в два раза (соотношение частоты встречаемости у населения, проживающего на выбранной территории, или в выбранной популяции к среднемировой частоте составляет >2);

(b) отбор не менее 5% (от 5% до 90%) мутаций и/или полиморфизмов не должен встречаться у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции людей, отличных от выбранной;

(c) отбор не более 10% (от 0% до 10%) мутаций и/или полиморфизмов, имеющих среднемировую частоту встречаемости, более чем в два раза превышающую частоту встречаемости у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции людей (соотношение среднемировой частоты к частоте встречаемости у населения, проживающего на выбранной территории, или в выбранной популяции >2);

(d) Отбор не более 5% (от 0% до 5%) мутаций и/или полиморфизмов, не встречающихся у этнических групп, проживающих на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции;

(e) отбор остальных мутаций и/или полиморфизмов (от 0-85%), встречающихся у этнических групп, проживающих на выбранной территории, или в выбранной популяции может быть равен в среднем общемировой или не может превышать ее более чем в два раза (соотношение частоты встречаемости у населения, проживающего на выбранной территории, или в выбранной популяции к среднемировой частоте составляет ≤2);

II) получение олигонуклеотидных зондов, содержащих ДНК-участки, позволяющие детектировать отобранные мутации и/или полиморфизмы;

III) нанесение олигонуклеотидных зондов на стеклянную пластину, покрытую аминосиланом или другим адгезивом нуклеиновых кислот, при этом одна из сторон пластины обработана таким образом, что распространение в ней лазерного луча происходит за счет эффекта полного внутреннего отражения.

Предпочтительно, чтобы зонды были подобраны таким образом, чтобы точно детектировать мутацию или полиморфизм, указанный как по смысловой, так и по антисмысловой цепи ДНК.

Для детекции мутаций и полиморфизмов зонды отбирают согласно следующим критериям:

- отсутствие внутренней вторичной структуры;

- способность участвовать в специфичной элонгации фрагментов генов, содержащих участки, позволяющие в дальнейшем идентифицировать мутации и полиморфные варианты генов.

Настоящее устройство микрочип может использоваться в составе комплекта для молекулярно-генетической диагностики на основе реакции элонгации праймеров на ДНК-микроматрицах.

Разработанный ДНК-микрочип в составе комплекта позволяет единовременно выявлять носительство мутаций и/или полиморфизмов, ассоциированных с наследственными заболеваниями, и применяется для молекулярно-генетической диагностики наследственных заболеваний; предрасположенности к мультифакторным заболеваниям, имеющим генетическую составляющую, и персональной генетически-детерминированной реакции на фармацевтические препараты.

Комплект для молекулярно-генетического исследования человека, проживающего на выбранной территории или в выбранной популяции, включает:

- Набор ферментов и реактивов для подготовки матрицы реакции элонгации праймеров на микрочипе (англ. Arrayed Primer Extention - APEX), состоящий из ДНК-полимеразы, раствора магния, растворов дизоксинуклеотидов, урацил-N-гликозилазы, щелочной фосфатазы креветки.

- Праймеры для реакции ПЦР мультиплексные

- Набор для очистки продуктов ПЦР

- Набор для реакции APEX: ДНК-полимеразы, раствора магния, растворов флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов для элонгации цепи

- ДНК-микрочип, адаптированный для молекулярно-генетического исследования людей, проживающих на определенной географической территории.

Применение наборов на основе технологии APEX описано в US 20070134691.

В качестве метода анализа ДНК-микрочипа был выбран способ, описанный в EP 1088214, что позволяет повысить точность, упростить методику генетической диагностики и сделать ее экономически выгодной.

Способ молекулярно-генетического исследования человека, принадлежащего к этносу, проживающему на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции, предусматривает использование нового комплекта для диагностики и регистрацию результатов анализа путем сравнения интенсивности флуоресцентных сигналов, при облучении ДНК-микрочипа лазерами различной длины волны.

Осуществление изобретений

Осуществление заявленной группы изобретений приведено на примере разработки средств для диагностики и ее осуществления для популяции людей, проживающих на территории Российской Федерации, однако данный принцип может быть применен к любой территории или государству.

Перечень и последовательность зондов, содержащих участки, позволяющие в дальнейшем идентифицировать мутации и полиморфные варианты генов, указанные в Таблице 1, представлена в Таблице 2.

В качестве мутаций, относящихся к категории (a) алгоритма отбора, можно привести следующие:

В качестве мутаций, относящихся к категории (b) алгоритма отбора, можно привести следующие:

В качестве мутаций, относящихся к категории (с) алгоритма отбора, можно привести следующие:

В качестве мутаций, относящихся к категории (d) алгоритма отбора, можно привести следующие:

В качестве мутаций, относящихся к категории (e) алгоритма отбора, можно привести следующие:

Микрочип отличается нуклеотидной последовательностью зондов, закрепленных на ДНК-микрочипе для прохождения реакции элонгации праймеров на чипе (англ. Arrayed Primer Extention - APEX). В ходе реакции амплифицированные и фрагментированные участки генома, содержащие анализируемые мутации, денатурируются и наносятся на ДНК-микрочип.

Заявленный ДНК-микрочип используется в составе комплекта (см. таблицу 3) для диагностики наследственных заболеваний, осуществляемой в несколько этапов:

1) Получение геномной ДНК человека непосредственно из клинического образца (цельной периферической или пуповинной крови, или эритроцитарной массы или другого биологического образца).

2) Амплификация участков ДНК, содержащих мутации и полиморфизмы с использованием специфично подобранных праймеров.

3) Очистка продуктов ПЦР.

4) Фрагментация продуктов ПЦР.

5) Гибридизация полученных одноцепочечных фрагментов на ДНК-микрочипе с последующим достраиванием зондов на один специфично-меченный флуоресцентным маркером нуклеотид в месте мутации. При этом в качестве матрицы используются образцы анализируемой ДНК.

6) Регистрация результатов анализа путем сравнения интенсивности свечения флуоресцентных сигналов, при облучении ДНК-микрочипа лазерами различной длины волны.

Проведение ПЦР и фрагментации ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для амплификации (увеличения копийности) участков геномной ДНК, несущих целевые мутации или однонуклеотидные полиморфизмы (SNP).

Часть дТТФ заменяется в ПЦР-миксе на дУТФ, что обеспечивает возможность дальнейшей фрагментации с помощью Урацил N-Гликозилазы (UNG). Продукты ПЦР объединяют, концентрируют и очищают от не встроившихся дНТФ с помощью щелочной фосфатазы креветок (SAP). После обработки SAP и UNG образцы нагревают для инактивации ферментов и расщепления ДНК в месте встройки урацила. Фрагментация длинных продуктов ПЦР обеспечивает лучшую гибридизацию с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными на стекле.

Проведение реакции APEX

Непосредственно перед реакцией элонгации праймеров на чипе (англ. Arrayed Primer Extention - APEX) фрагментированные продукты ПЦР денатурируют и переносят в реакционной смеси на разработанный чип (массив олигонуклеотидов на стекле). Реакционная смесь содержит буфер, одноцепочечные ДНК, термостабильную ДНК-полимеразу и четыре различных, индивидуально меченных флуорофорами терминаторных нуклеотидов.

Матрицезависимая ДНК полимеразная реакция проводится при постепенно увеличивающейся температуре для того, чтобы минимизировать образования олигонуклеотидами нежелательных вторичных структур, кроме того, обеспечить эффективную гибридизацию с целевыми фрагментами ДНК и поддержать на высоком уровне активность полимеразы. После инкубации свободный и не присоединенный ковалентными связями материал отмывается, что обеспечивает наилучшее соотношение сигнал-шум.

Детекция

Обработанные слайды, несущие на себе массив олигонуклеотидов, прошедших реакцию APEX, сканируют в микрочиповом сканере Genorama® QuattroImager™ (см. EP 1088214). Четыре лазера (поодиночке) используют для возбуждения разных красителей. Четыре хорошо спектрально разделенных красителя возбуждают с помощью полного внутреннего отражения лазерного луча в толще стеклянного слайда, работающего как световод. Свет, излучаемый флуорофорами в ответ на возбуждение, регистрируют с помощью ПЗС-камеры.

Поскольку для каждой реакции используют четыре различных красителя, для каждого микрочипа снимают четыре различных изображения излученного света. Каждый снимок соответствует своему красителю, соответственно отражает паттерн встраивания на чипе одного из четырех терминаторных нуклеотидов.

Анализ изображений и информации.

Сканирование сопровождается анализом с помощью Genorama® Genotyping Software™ («лазерный диск для генотипирования») для перевода информации о паттерне флуоресценции в нуклеотидную последовательность. Сначала нормируются интенсивности сигналов соответствующих красителей нуклеотидов-терминаторов. Сравниваются интенсивности сигналов в каждой точке расположения олигонуклеотидов во всех четырех изображениях, и наиболее интенсивный сигнал интерпретируется как соответствующий нуклеотид. В зависимости от того, встраивание какого нуклеотида произошло в точке мутации, делают вывод о статусе ее носительства у конкретного пациента.

Таким образом, уникальный набор мутаций и полиморфизмов может быть генотипирован с помощью разработанного микрочипа.

Обеспечена высокая специфичность (98%) и чувствительность (96%) при использовании в составе комплекта данного микрочипа для генетической диагностики при помощи реакции элонгации праймеров на ДНК-микроматрицах.

Данный микрочип позволяет детектировать мутации и полиморфизмы, а также ассоциированные с ними наследственные моногенные заболевания и предрасположенности к мультифакторным заболеваниям, включая муковисцидоз в одном исследовании, приведенные в таблице 1. ДНК-микрочип сфокусирован на популяцию России и предназначен для диагностики наиболее частых мутаций, ассоциированных с наследственными заболеваниями, и наиболее частых полимофризмов, ассоциированных с предрасположенностью к мультифакторным болезням и распространенных на территории Российской Федерации.

Клинические примеры

Клинический пример 1.

Больная Р-ва. Материалом для скринингового исследования служил образец эритроцитарной массы пуповинной крови.

Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на 216 мутаций.

С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больной Р-вой была выявлена ассоциированная с галактоземией мутация в гомозиготной форме с.-119 del/del в гене GALT.

Клинический пример 2.

Больная К-ва. Материалом для скринингового исследования служил образец периферической крови.

Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на 216 мутаций.

С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больной К-вой была выявлена ассоциированная с наследственной нейропатией зрительного нерва Лебера мутация в митохондриальном геноме. m. 1527A в гене MTCYB.

Клинический пример 3.

Больной С-ян. Материалом для скринингового исследования служил образец эритроцитарной массы пуповинной крови.

Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на 216 мутаций.

С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больного С-яна была выявлена ассоциированная с периодической болезнью мутация в гомозиготной форме c.442C/C в гене MEFV.

ДНК-микрочип может применяться для молекулярно-генетической диагностики в больницах, клинико-диагностических лабораториях и научно-исследовательских институтах. Данные исследования позволят здоровым людям получить информацию о своих генетических особенностях для поддержания собственного здоровья, а также предупредить рождение в их семье детей с тяжелой наследственной патологией.