Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения резистентности эритроцитов

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, гематологии, хирургии и к лабораторным методам исследования в указанных областях и в физиологии. Изобретение также может быть использовано в ветеринарии.

Важное значение при диагностике заболеваний имеет осмотическая резистентность - сохранение устойчивости оболочки клетки при разрушительных воздействиях: тепловых, осмотических, механических, химических и других. Как правило, отклонения от нормальных показателей резистентности свидетельствуют о нарушении работы организма.

Особое устройство мембраны эритроцитов позволяет им захватывать молекулы кислорода в капиллярах легких и транспортировать его к тканям и органам. Однако, при некоторых заболеваниях структура оболочки эритроцитов становится менее устойчивой и легко разрушается. Такие изменения приводят к значительному уменьшению количества красных телец в крови и последующему нарушению кислородного обмена в тканях организма.

Определение резистентности имеет большое значение в диагностике токсикозов, различных заболеваний крови: анемий, гемобластозов, полицитемии.

Известен «Способ определения перекисной резистентности эритроцитов» (патент №2134420, МПК G01N 33/50), заключающийся в определении перекисной резистентности эритроцитарных мембран, включая действие эрит-роцитарной каталазы, измерением оптической плотности трех проб: оценка величины спонтанного гемолиза (без Н₂О₂), оценка величины гемолиза, вызванного добавлением Н₂О₂, а затем - 100% гемолиза, вызванного детергентом. Для исследования используется одна порция суспензии эритроцитов.

Недостатками данного способа являются высокая трудоемкость, заключающаяся в значительных затратах времени, сопряженными с возможными неточностями в навесках, в большом числе измерений на спектрофотометре и в применении центрифугирования. Это увеличивает время выполнения теста, а также возможность изменения интенсивности поглощения света в зависимости от формы гемоглобина в растворе (ок-сигемоглобин, восстановленный гемоглобин).

Известен «Способ определения кислотной стойкости эритроцитов» (патент №2242760, МПК G01N 33/49), взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что берут кровь из локтевой вены, перемешивают с антикоагулянтом (3,8% цитрат натрия) и дважды подвергают центрифугированию, отсасывая плазму и надосадочную жидкость пипеткой и разводя оставшуюся эритроцитарную массу с 0,85% раствором хлорида натрия. Затем 0,3 мл полученной эритроцитарной взвеси помещают в кювету со встроенной магнитной мешалкой анализатора агрегации "Биола", в нее же при постоянном помешивании на скорости "2" (температура 37°С) вводят 0,05 мл 1% раствора уксусной кислоты.

Записывают график с двумя кривыми, где первая отражает динамику изменения среднего размера частиц (эритроцитов) при воздействии на них кислотного гемолитика. Вторая кривая характеризует изменение величины светопропускания лазерного пучка при прохождении через эритроцитарную взвесь в тот или иной момент гемолиза. В заключение рассчитывают индекс кислотной стойкости, объединяющий параметры обеих кривых и отражающий устойчивость исследуемых эритроцитов к воздействию кислотного гемолитика.

Известный способ обладает высокой сложностью, трудоемкостью, требует специальной аппаратуры и больших затрат времени.

Задачей заявленного изобретения является упрощение способа и снижение затрат времени на его выполнение.

Поставленная задача осуществляется тем, что согласно способу определения резистентности эритроцитов, включающему забор крови и воздействие на нее тестовым раствором с последующим определением уровня резистентности, где в качестве тестового раствора используют фермент трипсин с концентрацией 2%, уровень резистентности эритроцитов определяют исходя из формирования «теней» эритроцитов в виде сохранившейся плазмолеммы в пяти временных интервалах по 1 мин в каждом, и при значении числа гемолизированных эритроцитов 50% и более в первые 5 минут исследования судят о снижении резистентности эритроцитов.

Преимуществами предлагаемого способа являются короткое время получения результатов, простота в исполнении, высокая регламентированная точность, отсутствие дорогостоящей аппаратуры и препаратов.

Способ определения резистентности эритроцитов осуществляется следующим образом. Перед проведением исследования берут венозную кровь в объеме 1 мл и добавляют 0,1 мл гепарина. Затем 100 мкл забранной крови добавляют в 2 мл инкубационной среды (натрий-фосфатный буферный раствор Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, рН 7,2-7,4), размешивают и отбирают 25 мкл полученного раствора. К нему добавляют 50 мкл 2% трипсина и вносят смесь крови и трипсина в исследовательскую камеру Горяева 5-10 мкл, нанося ее к краю покровного стекла. Для определения процента эритроцитов, проявляющих реакцию гемолиза в виде формирования их «теней» (сохранившейся плазмолеммы), подсчитывают сохраненные эритроциты, находящиеся в 4 малых делениях клетки сетки камеры Горяева. Наблюдения проводят под визуальным контролем или используют фотосъемку в первые 5 минут исследования.

Если процент эритроцитов, подвергшихся гемолизу в первые 5 минут исследования, будет равен 50% и более, делают заключение о снижении резистентности эритроцитов.

Представленный нами способ можно отнести к экспресс-анализу.

Пример 1.

У больного А. была взята кровь на исследование, проведен общий анализ крови. Получены следующие результаты: RBC=3.50* 10^12, HGB 95 г/л. Затем с подозрением на гемолиз указанным выше способом проведено исследование - определен процент гемолизированных клеток крови в первые 5 минут. В результате получены данные - 63% гемолизированных эритроцитов в первые 5 минут исследования. На основании полученных данных сделано заключение о наличии сниженной резистентности на фоне анемии и назначено лечение. Данное заключение было подтверждено дополнительным диагностическим методом определения осмотической резистентности эритроцитов по Лимбеку и Рибьеру (Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / В.Е. Предтеченский, под ред. Е.А. Кост, Л.Г. Смирновой. - 6-е изд., стер. - М.: Медицина, 1964. - с. 96-97).

Пример 2.

У больного В. была взята кровь на исследование, проведен общий анализ крови. Получены следующие результаты: RBC=3.90*10^12, HGB 130 г/л. Затем с подозрением на гемолиз указанным выше способом проведено исследование - определен процент гемолизированных клеток крови в первые 5 минут. В результате получены данные - 1% гемолизированных эритроцитов в первые 5 минут исследования. На основании полученных данных сделано заключение об отсутствии гемолиза и наличии нормальной резистентности эритроцитов. Данное заключение было подтверждено дополнительным диагностическим методом определения осмотической резистентности эритроцитов по Лимбеку и Рибьеру.