СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике злокачественных новообразований и клинической биохимии.

Диагностика рака шейки матки (РШМ) в начальных стадиях представляет большие трудности. Как правило, на ранних стадиях заболевания клинических симптомов нет или они связаны с сопутствующими воспалительными, фоновыми заболеваниями [Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии. - СПб.: Фолиант, 2002. - 539 с.]. Для диагностики рака шейки матки применяют следующие методы: кольпоскопческий, цитологический, гистологический.

Кольпоскопия относится к методам визуальной оценки состояния эктоцервикса с выявлением очагов поражения для осуществления прицельной биопсии. Чувствительность и специфичность кольпоскопического метода варьирует в пределах 41,8%-87.8% и 78,8%-93,2%, соответственно [Evangelos P. Agnantis expanded cytological referral criteria for colposcopy in cervical screening: Comparison with human Papillomavirus testing / Gynecologic Oncology. - 2001. - Vol.82, N 2. - P.355-359]. Метод простой, легко доступный, не требует больших материальных затрат. Существенными недостатками этого метода являются: субъективность в оценке результатов, требуется высокая квалификация врача, а также невозможность диагностики злокачественных поражений, локализованных в области цервикального канала, составляющих большинство патологий шейки матки [Шуваева Н.И., Коротких И.Н. Клиника, диагностика рака цервикального канала: методические рекомендации. - М., 1984. - 10 с.].

Для ранней диагностики рака шейки матки широко используется цитологический метод исследования мазков, полученных с поверхности шейки матки и цервикального канала. Метод прост, легко доступен. Вместе с тем, цитологический метод не является совершенным. Согласно обобщенным данным, чувствительность рутинного цитологического метода колеблется от 5% до 83,3%, а специфичность 36-76,9% [Подистов Ю.И. Сопоставление результатов цитологического исследования и данных молекулярно-биологического метода HYBRID CAPTURE II у больных предраком шейки матки / Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №8. - С.43-45]. К недостаткам цитологического метода относятся: технические ошибки, связанные с нарушением техники получения мазков, субъективность в оценке цитологических результатов, инвазивность метода.

Решающим методом диагностики рака шейки матки является биопсия с последующим гистологическим исследованием [Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии. - СПб.: Фолиант, 2002. - 539 с.]. С целью получения материала для гистологического исследования применяют прицельную биопсию и конизацию шейки матки. При отрицательных результатах биопсии наиболее эффективным методом является конизация шейки матки. Метод является инвазивным и не может быть использовн при массовых обследованиях населения. Недостатком гистологического исследования является также невозможность многократного применения данного метода диагностики при обследовании одной и той же пациентки [Хмельницкий O.K. Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний шейки и тела матки. - СПб.: Sotis, 2000. - 332 с.].

В последние годы в скрининге рака шейки матки все большее внимание уделяется использованию определения уровня маркеров опухолевого роста в крови. Наиболее информативными опухолевыми маркерами в диагностике рака шейки матки в настоящее время признаны антигены SCC (антиген плоскоклеточного рака) и РЭА (раково-эмбриональный антиген). Определение этих антигенов основано на взаимодействии специфических моно- или поликлональных антител с антигенными детерминантами белковой природы.

Для мониторинга течения заболевания, прогноза и эффективности проводимого лечения применяется антиген плоскоклеточного карциномы (SCC). Диагностическая чувствительность SCC при плоскоклеточном РШМ составляет 60-87%, специфичность 41-91% [Gaarenstroom, K.N. Can initial serum Cyfra 21-1, SCC antigen, and TPA levels in squamous cell cervical cancer predict lymph node metastases or prognosis // Gynecol Oncol. - 2000. - Vol.77. - P.164-170]. Многочисленные исследования показывают повышение уровня SCC в зависимости от стадии процесса, размеров опухоли, глубины инвазии. Считается, что повышение уровня SCC связано со стадией заболевания, но не прогнозирует метастазирование в лимфоузлы, и не является маркерами раннего выявления РШМ [Can initial serum cyfra 21-1, SCC antigen, and TPA levels in squamous cell cervical cancer predict lymph node metastases or prognosis? / Katja N. et.al. // Gynecol. Oncology. - 2000. - Vol.77, N 1. - P.164-170].

РЭА является универсальным опухолевым маркером [СЕА, СА 50 and CA 242 in patients surviving colorectal cancer without recurrent disease / B. Engaras, et. al. // Eur. J. Surgi. Oncology. - 2001. - Vol.27, N 1. - P.43-48]. Широкое использование определения РЭА в диагностике РШМ ограничивается низкой чувствительностью. При высокой специфичности определения РЭА - 98% чувствительность составляет около 33%. Повышение уровня РЭА отмечается при дисплазии тяжелой степени, плоскоклеточном раке шейки матки, при прогрессии опухоли или метастазах [Baaron Т. Increased carcinoembryonic antigen expression in cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and in cervical squamous cell carcinoma // Hum. Pathol. - 2000. - Vol.31, N 11. - P.1357-1362]. Использование РЭА в классическом определении (из сыворотки крови) актуально лишь в качестве мониторинга излеченности заболевания.

В настоящее время с целью диагностики РШМ изучаются вирусные и тканевые биомаркеры. К таковым относятся: онкобелки Е6 и Е7, белок p 53, пролиферативные маркеры (Ki 67), плоидность ядер, генные исследования, HPV типирующие методы. Но определение этих маркеров в практическом здравоохранении на сегодняшний день не нашло широкого применения, а используется преимущественно в лабораторной практике [Автандилов Г.Г. Плоидометрическая диагностика предраковых процессов и рака шейки матки по цитологическим препаратам // Клиническая лаб. диагностика. - 2004. - №11. - С.45-47].

Известно использование лектинов для диагностики рака, которое реализуется по двум основным направлениям. Первое направление осуществляется при выявлении лектинами углеводных детерминант в сыворотке крови на твердой фазе (лектин-ферментные и лектин-иммуноферментные методы) или геле, и второе направление заключается во взаимодействии лектинов с соответствующими лигандами, экспрессированными на поверхности клеток, получаемых путем смывов, выделением из крови, а также на срезах биопсийного материала.

Так, определение индекса фукозилирования альфа-фетопротеина сыворотки крови рекомендовано для ранней диагностики рака печени при патологиях этого органа [The fucosylation of alfa-fetoprotein and its usefulness in the early diagnosis of hepatocellular carcinoma / Yutaka Aoyagi, et. al. // Cancer, 1988. - Vol.61. - N.4. P.769-774]. Индекс фукозилирования рассчитывался как соотношение лектин-реактивных видов альфа-фетопротеина к его общей концентрации, определенной иммуно-ферментным методом. Чувствительность анализа, основанного на определении индекса фукозилирования для пациентов с диагнозом рака печени, составила 69%, специфичность анализа для доброкачественных заболеваний составила 96%. Определение индекса фукозилирования альфа-фетопротеина в сыворотке крови является полезным маркером для ранней диагностики рака печени, особенно на ранних стадиях у пациентах с хроническим циррозом печени. Вместе с тем необходимо отметить инвазивность метода и сравнительно низкую чувствительность анализа для пациентов с диагнозом рака печени.

Известен способ диагностики рака шейки матки, в котором используют конъюгат манноз-связывающего лектина конковалина А с пероксидазой хрена для дифференцировки нормальных и опухолевых плоских слущенных эпителиальных клеток [Concanavalin А-Peroxidase labeling in cervical exfoliative cytopathology / J. Hans M. Davina, et. al. // Gynecologic Oncology, 1985. - Vol.22. - I.2. - P.212-223]. Оба типа клеток метились конъюгатом, но существенные различия наблюдались по интенсивности связывания. Статистический анализ показал, что у 99% здоровых пациентов процент мечения клеток составлял 45%, тогда как только для 1% пациентов с диагнозом рака шейки матки процент составлял свыше 30%. При этом у здоровых пациентов процент мечения клеток в среднем составлял 73% (от 54 до 94%), у пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом рака шейки матки процент мечения клеток в среднем составлял 15% (от 10 до 22%) К недостаткам метода можно отнести инвазивность, а также трудности в получении информативного материала, так как его получение в значительной степени зависит от опыта и квалификации исследователя, от способности клеток к эксфолиации и гистологической структуры опухоли.

Наиболее близким к заявляемому способу является лектин-иммуноферментный метод диагностики рака шейки матки, основанный на определении TN - А антигена (Tomsen-Frienderich antigen) в сыворотке крови пациентов с помощью лектина арахиса (PNA lectin, ЛА) [Alagarsamy L.M. et. al. Enzyme-linked PNA lectin-binding assay of serum T-antigen in patients with SCC of the uterine cervix / J. Cancer Letters, 149 (2000) 207-211]. Лектин взаимодействует с терминальным дисахаридом Gal(β-1,3)NAcGalN. Чувствительность этого метода составляет 80%, а специфичность - 82%. При высоких значениях положительных предсказаний (93%) определение TN - А антигена лектином арахиса имеет низкие значения отрицательных предсказаний (59%). Кроме того, эти данные статистически достоверны только для 3 и 4 стадии рака. Метод не может быть использован для дифференциальной диагностики РШМ и может быть отнесен как вспомогательный анализ. К недостаткам метода можно отнести инвазивность.

Задача изобретения - усовершенствование методов диагностики рака шейки матки, разработка высокочувствительного и высокоспецифичного метода диагностики, мониторинга эффективности лечения и выявления рецидивов рака шейки матки.

Задача решена тем, что в известном способе диагностики рака шейки матки путем лектин-иммуноферментного метода согласно изобретению исследуют вагинальный секрет, в котором определяют уровень лектин-связанных РЭА/РЭА-подобных антигенов, а в качестве лектина используют маннан-связывающий лектин, полученный из целомической жидкости дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus.

В основе заявляемого способа заложена способность лектина, выделенного из целомической жидкости дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus (МСЛ-Т), выявлять биохимические изменения в структурах углеводных цепей, сопровождающих злокачественную трансформацию, и, как следствие этого, по-разному взаимодействовать с углеводными цепями РЭА/РЭА-подобных антигенов, продуцируемых здоровыми клетками, клетками доброкачественных и злокачественных опухолей шейки матки.

Метод основан на выявлении двух типов антигенных детерминант, один из которых является белковым и специфически распознается антителами против РЭА, сорбирующим молекулы РЭА/РЭА-подобных антигенов из экстрактов вагинальных секретов. Второй тип антигенных детерминант имеет углеводную природу и распознается МСЛ-Т. Результат этих взаимодействий позволяет рассчитать в условных единицах количество лектин-связанных форм РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальных секретах пациентов.

МСЛ-Т получен из целомической жидкости дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus и относится к лектинам С-типа. Он обладает гомоолигомерной структурой с молекулярной массой субъединицы 17 кДа. Активность лектина эффективно ингибируется разветвленными дрожжеподобными D-маннанами, построенными из α(1-2), α(1-6) - связанных остатков D-маннозы, гликопротеинами, содержащими углеводные цепи O-типа (раково-эмбриональный антиген, эмбриональный α₁ кислый гликопротеин).

Характерной особенностью МСЛ-Т является то, что он не ингибируется моносахаридами, входящими в состав углеводных цепей нормальных гликоконъюгатов человека, и не взаимодействует с компонентами сыворотки крови человека, что существенно влияет на специфичность выявления качественных изменений в структуре углеводных цепей, сопровождающих злокачественное перерождение клеток.

К МСЛ-Т получены высокоспецифические антитела. Схема постановки метода состоит из нескольких этапов, включающих селективную сорбцию РЭА/РЭА-подобных антигенов антителами и взаимодействие их углеводных структур с МСЛ-Т. Определение концентрации лектин-связанных структур РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете является принципиально новым подходом при выявлении злокачественных новообразований у женщин.

Заявляемый способ диагностики рака шейки матки включает следующие стадии:

1. Адсорбция поликлональных антител против РЭА в лунках полистирольного микропланшета (Ат-РЭА).

2. Стадия блокировки свободных центров связывания.

3. Инкубация адсорбированных антител Ат-РЭА с антигенами (Аг):

а) с раствором РЭА, используемого в качестве положительного контроля и для построения калибровочной кривой;

б) с экстрактами вагинальных секретов.

4. Инкубация МСЛ-Т с полученными ранее комплексами Ат-РЭА-Аг.

5. Иммунодетекция комплексов Ат-РЭА-Аг-(МСЛ-Т) антителами против МСЛ-Т, меченных пероксидазой хрена.

6. Цветная визуализация конечного комплекса субстратом.

7. Определение в условных единицах концентрации (уровня) лектин-связанных структур РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете относительно калибровочной кривой.

Были исследованы вагинальные секреты, полученные у 90 женщин, средний возраст которых составил 46,4±0,6 года. В экспериментах, проведенных с вагинальными секретами 3 групп женщин - здоровых (30), с доброкачественными поражениями шейки матки (30) и при раке шейки матки (30), были показаны существенные различия в связывании МСЛ-Т с углеводными компонентами секретов в этих группах.

Согласно результатам проведенного исследования концентрации лектин-связанных РЭА/РЭА-подобных антигенов (ЛСА), выраженные в условных единицах, в вагинальном секрете здоровых женщин и с доброкачественными изменениями близки по своим значениям и в среднем составляют 48.5±11.8 U/ml. Среднее значение концентраций ЛСА в секретах женщин с диагностированным раком шейки матки составляет 11.4±7.5 U/ml. Установлены статистически достоверные различия значений ЛСА между здоровыми женщинами и пациентками с диагнозом рака шейки матки (p<0,001), а также между пациентками с доброкачественными и злокачественными заболеваниями (p<0,001).

Разработанный лектин-иммуноферментный метод диагностики РШМ, основанный на определении РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете, является перспективным и представляет интерес для практической онкологии.

Технический результат заявляемого способа диагностики рака шейки матки заключается в следующем.

По своим основным параметрам (чувствительность, специфичность) он превосходит известные методы определения опухолевых маркеров РЭА и SCC в сыворотке крови.

При специфичности 93,6% (против 82% способа-прототипа) его чувствительность составляет 87,8%, что превышает аналогичный показатель способа-прототипа (80%). Предсказательная ценность положительного диагноза в исследовании составляет 87%, а предсказательная ценность отрицательного диагноза имеет очень высокое значение и составляет 95,2% (против 59% способа-прототипа). В способе-прототипе углеводная детерминанта определяется в пуле антигенов сыворотки. В случаях, связанных с биосинтезом TN - А антигена опухолями другой локализации, возможно получение ложноположительных результатов. В заявляемом способе взятие образца происходит непосредственно в районе локализации вероятной опухоли и исследуемый антиген избирательно сорбируется специфическими антителами, что способствует получению достоверных и воспроизводимых результатов.

Заявляемый способ в отличие от известного не является инвазивным. Другое его достоинство то, что получаемые результаты не зависят от возраста и физиологического состояния женщин. Он может быть использован для массового обследования (на одном микропланшете одновременно анализируется 40 образцов). Значительное, достоверное снижение уровня лектин-связанных форм РЭА/РЭА-подобных антигенов выявляется для всех стадий злокачественной трансформации Т_0-1-T₄.

Примеры диагностики.

Пример 1. Пациентка Ж., 46 лет, 17 день овариально-менструального цикла. Клинический диагноз: здорова, профилактический осмотр. Получен материал на цитологическое исследование и вагинальный секрет. Цитологическое исследование мазков: из эндоцервикса - клетки железистого эпителия, небольшие скопления клеток плоского эпителия без атипии; эктоцервикс - клетки преимущественно промежуточного эпителия без атипии. Цитологическое заключение соответствует физиологическому состоянию женщины.

Уровень лектин-связанных форм РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете составил 45,24 U/ml, что позволило отнести данную пациентку в группу здоровых женщин. Этот вывод совпадает с клиническим и цитологическим диагнозами.

Пример 2. Пациентка Т., 43 года, 12 день овариально-менструального цикла. Выявлена при проведении профилактического осмотра. Из анамнеза: на протяжении пяти лет ежегодно проходила профилактический осмотр у гинеколога, активных жалоб не предъявляла. Кольпоскопическая диагностика была затруднена в связи с отсутствием визуализации зоны перехода за счет рубцовой деформации наружного зева после диатермокоагуляции.

На исследование были взяты вагинальный секрет, материал на цитологическое исследование и биопсия. Материал на цитологическое исследование был получен из эктоцервикса. Цитологическое заключение: клетки поверхностного, промежуточного эпителия без атипии, что соответствует физиологической норме. Гистологическое заключение от 05.12.05 №32519 (биопсия) - стационарный эндоцервикоз с образованием сосочковых структур и очагов эпидермизации. Эндоцервикс - участки многослойного плоского эпителия обычного строения, железы выстланы как кубическим эпителием, так и уплощенным эпителием, слизь, фибрин.

Уровень лектин-связанных форм РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете составил 10,45 U/ml. Учитывая данные обследования, больной была проведена конизация шейки матки. При гистологическом исследовании операционного материала было установлено: на фоне стационарного эндоцервикоза обнаружены структуры плоскоклеточного рака без ороговения.

Больной был выставлен диагноз: рак шейки матки T₂N_×M₀, что совпадает с предварительным диагнозом, выставленным по данным, полученным при исследовании вагинального секрета.

Пример 3. Пациентка Т., 41 год, 9 день овариально-менструального цикла. Выявлена при проведении профилактического осмотра. Из анамнеза: жалобы на сукровичные выделения из половых органов на протяжении четырех месяцев. При осмотре установлен предварительный диагноз: псевдоэрозия шейки матки, подозрение на рак. Был взят на исследование вагинальный секрет, материал на цитологическое исследование и биопсия.

Уровень лектин-связанных форм РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете составил 60,2 U/ml. Цитологическое заключение: материал, полученный из эндоцервикса и эктоцервикса, соответствует пролиферации клеток железистого эпителия, дисплазии умеренной степени, что соответствует предопухолевому состоянию эпителия шейки матки. Гистологическое заключение от 01.06.05 №24623-24 (биопсия) - стационарный эндоцервикоз с образованием сосочковых структур и очагов эпидермизации. В цервикальном канале обнаружены участки многослойного плоского эпителия обычного строения, слизь, фибрин, железы выстланы кубическим эпителием.

Заключение: псевдоэрозия шейки матки, что совпадает с предварительным диагнозом, выставленным по данным, полученным при исследовании вагинального секрета.

Таким образом, заявляемый способ диагностики, основанный на определении уровня лектин-связанных форм РЭА/РЭА-подобных антигенов в вагинальном секрете, позволяет:

1. Выявлять злокачественные заболевания шейки матки на доклинических этапах при отрицательных результатах других видов обследования (цитологического, гистологического).

2. При проведении массовых профилактических осмотров увеличить количество обследованных женщин, снизить кадровые и технические затраты.

3. Формировать группы риска по развитию рака шейки матки.

4. Осуществлять динамический мониторинг состояния эпителия шейки матки у женщин, входящих в группы риска.