СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА И КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА И ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу серологической диагностики иерсиниозов (псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза).

Иерсиниозные инфекции, вызываемые патогенными для человека Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica, относятся к широко распространенным в мире острым кишечным заболеваниям. Этиологическое родство возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза способствует определенному сходству этих инфекционных заболеваний. Иерсиниозы характеризуются подобием клинических форм и проявляются как в виде первично-очаговых форм (генерализованная, кишечная, абдоминальная и смешанная, ангинозная, острая респираторная, но и более редкая - кожная), так и в виде вторично-очаговых форм иерсиниозов (пневмонической, гепатитной, менинго-энцефалитической, септической и др.). При этом принципиальных различий в клинических признаках этих форм иерсиниозной инфекции в зависимости от вида возбудителя (Y. pseudotuberculosis или Y. enterocolitica) не выявлено [1-3]. При постановке первичного диагноза «иерсиниоз» практикующие врачи ориентируются, как правило, на клинические проявления заболевания. Псевдотуберкулез (ПСБ), например, характеризуется большей выраженностью токсико-аллергического синдрома, а кишечный иерсиниоз (КИ) - дисфункцией ЖКТ и органными поражениями [1-3]. Однако подобные различия в клинических признаках между ПСТ и КИ четко прослеживаются только при массовом проведение анализа и мало помогают в дифференциальной диагностике в каждом конкретном случае. В связи с этим установление этиологического диагноза при иерсиниозах только по его клиническим проявлениям особенно в ранние сроки и при спорадической заболеваемости практически невозможно [1-3]. Особенно часто диагностические ошибки возможны у детей раннего возраста, а также при тяжелой форме заболевания. Однако и при более легком течении инфекции у детей старшего возраста поставить правильный диагноз с учетом этиологии заболевания не удается без результатов лабораторного обследования [2]. Сложность верификации ПСТ от КИ только по клиническим проявлениям в большинстве случаев нередко приводит к ошибочному диагнозу, даже при типичном течении заболевания. Особую сложность при диагностике иерсиниозной инфекции в зависимости от этиологии возбудителя представляют случаи смешанной формы иерсиниозов, обусловленной одновременно Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. В связи с этим особую значимость при дифференциации обобщенного диагноза «иерсиниоз» (ПСБ и/или КИ) приобретает необходимость четкого разграничения данных инфекций при вспышечной заболеваемости, когда необходимы масштабные противоэпидемические мероприятия, с учетом некоторых различий в механизме передачи возбудителей ПСТ и КИ. Окончательный диагноз возможен только с использованием лабораторных методов обследования пациента. В соответствии с инструктивными документами [4] большое значение уделяется серологическим методам диагностики, направленным на выявление специфических антител к возбудителям иерсиниозов - Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Результаты исследования крови больных на наличие антител к определенному виду возбудителя позволяют ориентировать клинициста в тактике ведения больного и в определенной степени прогнозировать течение заболевания.

Используемые в практике лечебных учреждений серологические методы, основанные на реакции агглютинации (РА), разработаны для диагностики как ПСТ, так и КИ и обеспечивают верификацию либо ПСТ, либо - КИ [5, 6]. В связи с этим дифференциальная диагностика иерсиниозов с учетом этиологии требует последовательного использования различных типоспецифических диагностикумов: сначала для определения специфических антител к Y. pseudotuberculosis, затем - к Y. enterocolitica. Подобная схема анализа проводится поэтапно: для выявления антител к иерсиниям вначале ставят развернутую реакцию с диагностикумами к наиболее часто встречающимся сероварам Y. pseudotuberculosis (1 В) или к Y. enterocolitica (0:9 и 0:3). Затем, если возникнет в этом необходимость, РА ставят с диагностикумами к другим серовариантам Y. pseudotuberculosis (III, IV) или Y. enterocolitica (0:5,27, 0:8, 0:6 и др.). Таким образом, предлагаемая схема серологической диагностики иерсиниозов многоэтапна, трудоемка и длительна. Кроме того, поскольку в качестве антигена в РА используются живые культуры иерсиний, а реакция типоспецифическая, то необходимо иметь культуры иерсиний разных серологических вариантов, наиболее часто вызывающих заболевания. К недостаткам методов можно отнести также ретроспективность результатов анализа, так как антитела в диагностических титрах выявляются только на 2-3 неделях болезни.

Способы диагностики иерсиниозов, основанные на реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), разработаны для диагностики как ПСТ, так и для - КИ. Несмотря на определенные успехи по усовершенствованию этих диагностикумов, что позволило наладить их промышленный выпуск, они имеют также существенные недостатки [7, 8]. Предлагаемые способы характеризуются невысокой специфичностью, поскольку в реакции используются типоспецифические антигены - липополисахариды Y. pseudotuberculosis 1B и Y. enterocolitica 0:3 и 0:9 серовариантов, что не позволяет выявлять случаи заболеваний, вызванных другими серовариантами этих микроорганизмов. Кроме того, общепринятый многостадийный подход к диагностике иерсиниозов без учета этиологии возбудителя отличается длительностью анализа, перерасходом сыворотки крови больного, необходимых реагентов, материалов и др.

Для диагностики иерсиниозов в последние годы интенсивно разрабатывается иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием антигенов различной природы [9-12], однако предлагаемые варианты ИФА не позволяют проводить одномоментно дифференцирование ПСТ и КИ, а требуют поэтапного их использования, больших затрат времени и необходимых материалов.

Предложен способ диагностики иерсиниозов с помощью ИФА на основе протеинового антигена, свободно секретируемого в культивируемую среду разными видами иерсиний, в частности Y. pseudotuberculosis 1B сероварианта [12]. Однако этот способ не обеспечивает дифференциальной диагностики иерсиниозов с учетом этиологии возбудителя.

Известен способ дифференциальной диагностики иерсиниозов с использованием в ИФА типоспецифического антигена - липополисахарида (ЛИС) из Y. pseudotuberculosis 1 B сероварианта или ЛПС из Y. enterocolitica 0:3 и 0:9 серотипов [13]. Однако предлагаемый метод ввиду его типоспецифичности не позволяет диагностировать заболевания, вызванные Y. pseudotuberculosis II, III, IV серовариантами, и Y. enterocolitica 0:5, 0:6, 0:7, 0:8 и других серотипов. Кроме того, для верификации ПСТ от КИ необходимо поэтапное использование типоспецифических диагностикумов, например, сначала на ПСТ, затем - на КИ. Для проведения такого анализа требуются очищенные антигены из различных серологических вариантов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, на получение которых затрачивается значительное время, что усложняет диагностику.

Этот способ включает следующие этапы:

1) посадка антигена на полистироловый планшет, в качестве антигена используется инактивированный корпускулярный антиген из Y. enterocolitica 0:3 и 0:9 серовариантов;

2) отмывка планшета;

3) нанесение исследуемой сыворотки в диагностическом разведении;

4) отмывка планшета;

5) нанесение конъюгата;

6) отмывка планшета;

7) нанесение субстратной смеси;

8) регистрация результатов реакции.

В настоящее время промышленный выпуск иммуноферментных диагностикумов (ИФА тест-систем) на иерсиниозы в нашей стране не осуществляется. Методы дифференциальной диагностики иерсиниозов, предлагаемые разными авторами [9-12], не оснащены необходимыми наборами реагентов для проведения иммунодиагностики иерсиниоза.

Предлагаемые ИФА тест-системы характеризуются невысокой специфичностью и чувствительностью к выявлению иерсиниозов, обусловленных разными серологическими вариантами Y. pseudotuberculosis (II, III, IV) и Y. enterocolitica (0:5, 0:6, 0:7, 0:8 и другие), наиболее часто вызывающих заболевания, и не обеспечивают дифференциальной диагностики иерсиниозов в зависимости от этиологии возбудителя.

Задача изобретения - совершенствование дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза за счет одновременного определения этих инфекций, вызываемых разными серологическими вариантами возбудителей иерсиниозов, и разработка диагностического набора.

В результате решения поставленной задачи разработан способ дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, включающий определение специфических антител к возбудителям в сыворотке крови больного методом твердофазного иммуноферментного анализа, предусматривающего нанесение антигенов на планшет, в котором согласно изобретению на одну половину планшета наносят видоспецифический белок-порин наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis, за диагностический титр принимают разведение сыворотки 1:800, а на другую половину планшета наносят видоспецифический белок-порин наружной мембраны Yersinia enterocolitica, за диагностический титр принимают разведение сыворотки 1:1600 и верификацию псевдотуберкулеза от кишечного иерсиниоза осуществляют сравнением значений оптической плотности раствора реакций сыворотки крови больного с антигенами из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) и из Y. enterocolitica (ОП_Y.е.), при величине отношения ОП_Y.ps./ОП_Y.е. больше или равной 2,0 диагностируют псевдотуберкулез, при величине отношения ОП_Y.е./ОП_Y.ps больше или равной 2,0 диагностируют кишечный иерсиниоз, при величинах отношений ОП_Y.ps./ОП_Y.е. и ОП_Y.е./ОП_Y.ps. близких или равных 1,0, диагностируют смешанную форму иерсиниозной инфекции.

Диагностический набор на псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз содержит планшет с иммобилизованными антигенами - видоспецифическими белками-поринами наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica, образцы контрольных (положительной и отрицательной) сывороток крови и вторых общевидовых антител, емкости с готовыми для употребления инактивирующим и стоп-реагентами, субстратом и буферными системами.

Технический результат, обеспечиваемый группой изобретений, заключается в повышении специфичности и чувствительности иммуноферментной диагностики иерсиниозов. Заявляемый способ позволяет проводить дифференциальную диагностику псевдотуберкулеза от кишечного иерсиниоза и выявлять случаи смешанной формы иерсиниозной инфекции, обусловленной одновременно Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Способ является более простым, т.к. обеспечивает одномоментное проведение системного анализа из одного образца сыворотки крови больного на иерсиниоз с учетом этиологии возбудителя, что улучшает иммунодиагностику иерсиниозов, сокращает время проведения и стоимость анализа.

Порообразующие белки наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий являются иммунологическими маркерами, характерными для вида или рода микроорганизмов, и относятся к высокоиммуногенным компонентам бактериальной клетки, и определение антител к ним используется для диагностики инфекционных заболеваний [14].

Авторы заявляемого способа установили, что порины из НМ Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica являются видоспецифическими антигенами возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, антитела к которым обнаруживаются независимо от серологического варианта возбудителей как в антисыворотках лабораторных животных, иммунизированных лизатами клеток Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, так и в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом и кишечным иерсиниозом.

Способ осуществляется следующим образом: диагностику проводят по методике выявления специфических антител к возбудителям в сыворотке крови больного, используя стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, непрямой, неконкурентный анализ антител) [15]. В качестве антигенов используются одномоментно два видоспецифических порообразующих белка из НМ Y. pseudotuberculosis и из НМ Y. enterocolitica, выделенных в одинаковых условиях и по одной методике [16]. За диагностические титры в ИФА приняты разведения сывороток 1:800 для порина НМ Y pseudotuberculosis (согласно патенту RU №2153172 С1, 20.07.2000) и 1:1600 для порина НМ Y. enterocolitica.

Диагностический титр в ИФА тест-системе на основе порина из Y. enterocolitica определяли, сравнивая статистически достоверные значения [17], равные отношениям значений оптической плотности раствора реакций сывороток крови больных иерсиниозом с бактериологически подтвержденным диагнозом и здоровых людей (Р_оп/Р_зд) при различных разведениях, где F_оп=F_c+F_ф

F_c - значение оптической плотности раствора специфической реакции антиген/антитело (антитела - сыворотка крови больного с подтвержденным диагнозом, или положительный контроль),

F_зд - значение оптической плотности раствора реакции с сывороткой крови здорового донора, или отрицательный контроль,

F_ф - значение оптической плотности раствора неспецифической фоновой реакции.

Для исследуемых сывороток (57 сывороток крови больных с бактериологически подтвержденным диагнозом и 86 доноров) в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 1:3200 эти величины оказались соответственно равны 3,6; 4,0; 4,2; 5,5; 5,0; 4,1 (фиг.1). За диагностический титр приняли разведение сыворотки, для которого соотношение F_оп/F_зд оказалось наибольшим. Таким образом, в ИФА на основе порина из Y. enterocolitica за диагностический титр принято разведение 1:800-1:1600. Анализ сывороток крови больных иерсиниозом с помощью данной тест-системы на основе порина показал, что уровень специфических антител зарегистрирован в пределах 0,64-2,0 единиц оптической плотности раствора ферментативной реакции, что достоверно отличалось от контрольных значений (0,1-0,3 единиц оптической плотности раствора реакции).

Для подтверждения специфичности и чувствительности ИФА на основе порина из Y. enterocolitica нами было обследовано 657 сывороток крови больных с характерными клиническими признаками иерсиниоза (357 детей в возрасте от 1 года до 14 лет и 200 сывороток крови взрослых пациентов). Кроме того, учитывая полиморфизм иерсиниозной инфекции, были проанализированы 256 сывороток крови больных с острыми кишечными инфекциями, не обусловленных Y. enterocolitica (псевдотуберкулез - 134, сальмонеллез - 54, острые вирусные гепатиты (А и В) - 68). Верификация указанных заболеваний проводилась с учетом клинико-эпидемиологических, бактериологических и/или специфических серологических исследований. Контрольную группу составили 86 практически здоровых человек, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными.

В результате анализа было обнаружено, что сыворотки крови больных псевдотуберкулезом и сальмонеллезом в диагностическом титре (1:800) взаимодействуют с порином. Однако значения оптической плотности раствора реакции этих сывороток в 2-3 раза меньше значения оптической плотности раствора при взаимодействии порина с сыворотками крови больных иерсиниозом. При разведении этих сывороток 1:1600 - антитела к порину из Y. enterocolitica были определены на уровне отрицательного контроля. При анализе сывороток крови больных гепатитами антител к порину из Y. enterocolitica не обнаружено ни в одном из случаев (фиг.2). Следовательно, разведение сывороток крови 1:1600 в большей степени соответствует диагностическому титру в ИФА на основе порина из Y. enter ocolitica при верификации кишечного иерсиниоза. Полученные результаты свидетельствует о том, что предлагаемая тест-система позволяет эффективно и достоверно осуществлять дифференциальную диагностику иерсиниоза от других острых кишечных заболеваний. Следовательно, ИФА на основе порина из Y. enterocolitica является чувствительным методом диагностики иерсиниоза, обладает высокой специфичностью и не дает перекрестных реакций с антителами к возбудителям заболеваний, сходных по клинике с иерсиниозом.

Для осуществления дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза полистироловый 96-луночный планшет («Dynatech», Швейцария или «Costar», США) сенсибилизируют антигенами, на одну половину планшета наносят видоспецифический белок-порин НМ Y. pseudotuberculosis, а на другую половину планшета - видоспецифический белок-порин НМ Y. enterocolitica и проводят анализ по сдандартной методике.

Анализ состоит из следующих этапов:

1) посадка антигенов на твердый носитель (96 луночный полистироловый планшет) (концентрация каждого антигена - 5 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере с рН 9.0);

2) отмывка планшета от несвязавшихся компонентов 3-5 раз по 5 мин буфером "В", состоящим из фосфатно-солевого буфера рН 7,4 (буфер "А") + 0,05% твин-20 (или твин-80);

3) инактивация планшета (предотвращение неспецифического связывания антигена с антителами) буфером "С", состоящим из фосфатно-солевого буфера рН 7,4 (буфер "А") + 0,1% твин-20;

4) нанесение исследуемой сыворотки в двух параллелях с каждым из антигенов в диагностических разведениях (1:800 для порина из Y. pseudotuberculosis и 1:1600 для порина из Y. enterocolitica) готовится с использованием буфера "В";

5) отмывка планшета;

6) нанесение конъюгата (вторые общевидовые антитела, меченные пероксидазой хрена): рабочее разведение (1:1000) готовится в буфере "С";

7) отмывка планшета;

8) нанесение субстрат-индикаторного раствора: 0.04% о-фенилендиамин в цитратно-фосфатном буфере (рН 5.0) + 10 мкл 33% Н₂О₂ (в расчете на 10 мл буфера);

9) нанесение стоп-реагента: 0,5М раствор серной кислоты (H₂SO₄) готовится при разбавлении 1 мл концентрированной H₂SO₄ в 15 мл дистиллированной воды;

10) регистрация результатов реакции.

Для исследования диагностических качеств и специфичности предлагаемой ИФА тест-системы на основе поринов из НМ Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica обследовано 194 больных в возрасте от 1 года до 14 лет; из них - 146 больных иерсиниозом и псевдотуберкулезом, 48 больных - с этиологически расшифрованной кишечной инфекцией (сальмонеллез). Диагностика указанных заболеваний проводилась с учетом клинико-эпидемиологических, бактериологических и/или специфических серологических исследований. Контрольную группу составили 27 практически здоровых человек, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными.

С помощью ИФА на основе поринов из Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica при анализе сывороток крови больных с первичным диагнозом «иерсиниоз» установлено, что сыворотки крови больных иерсиниозами взаимодействуют в диагностических титрах (1:800 для ПСТ и 1:1600 для КИ) с поринами из обоих микроорганизмов.

При сравнении статистически достоверных средних значений оптической плотности раствора положительных реакций с использованием обоих антигенов [17] в 73% случаев установлено, что значения оптической плотности раствора в реакции с порином из Y. enterocolitica (ОП_Y.е.) в 2 раза больше подобного показателя реакции с порином из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) (ОП_Y.е./ОП_Y.ps.>2,0), что подтверждает этиологию заболевания, вызванного Y. enterocolitica (фиг.1а). В 22,3% случаев установлено, что значение оптической плотности раствора в реакции сывороток крови в диагностическом титре (1:800) с порином из Y. pseudotuberculosis в 2 раза больше подобного показателя реакции при взаимодействии этих же сывороток в диагностическом титре (1:1600) с порином из Y. enterocolitica (ОП_Y.е./ОП_Y.ps.>2,0), что подверждает этиологию псевдотуберкулезной инфекции (фиг.1б). В 4,7% случаев с помощью ИФА тест-системы была обнаружена смешанная форма иерсиниозной инфекции. Так, при взаимодействии сывороток (в диагностическом титре 1:800) с порином из Y. pseudotuberculosis значение оптической плотности раствора в реакции было близким (или равным) значению оптической плотности раствора реакции при взаимодействии этих же сывороток (в разведении 1:1600) с порином из Y. enterocolitica (ОП_Y.ps.=ОП_Y.е.е) (фиг.1в). В случае сывороток крови больных сальмонеллезом в диагностических титрах (1:800 для ПТБ и 1:1600 для КИ) положительных реакций в ИФА с поринами иерсиний обнаружено не было.

Таким образом, предлагаемая ИФА тест-система на основе поринов НМ Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica является высокоспецифичным, эффективным и чувствительным методом, позволяющим дифференцировать иерсиниоз от псевдотуберкулеза и выявлять смешанные формы иерсиниозной инфекции, обусловленные одновременно Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

На фиг.1 представлено определение уровня специфических антител к порину из Y. enterocolitica в сыворотках крови больных иерсиниозом с подтвержденным диагнозом (ряд 1) и здоровых людей (ряд 2) при различных разведениях (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 - точки 1, 2, 3, 4, 5, 6 соответственно) с помощью ИФА на основе порина из Y. enterocolitica.

На фиг.2 представлен анализ сывороток крови больных (сальмонеллезом, иерсиниозом, псевдотуберкулезом, гепатитами) и доноров в разведении 1:800 (ряды 1, 2, 3, 4, 5) и 1:1600 (ряды 7, 8, 9, 10, 11) с помощью ИФА тест-системы на основе порина из Y. enterocolitica.

На фиг.3 (а, б, в) представлено определение антител к поринам НМ Y. pseudotuberculosis и У enterocolitica в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом (ПСТ) и кишечным иерсинозом (КИ) с помощью ИФА с учетом этиологии заболевания: 1 - ПСТ (разведение сыворотки 1:800), 2 - КИ (разведение сыворотки 1:1600):

а) верификация кишечного иерсиниоза: среднее значение оптической плотности раствора в реакции с порином из У enterocolitica (ОП_Y.е.) в 2 раза больше среднего значения оптической плотности раствора в реакции с порином из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) - ОП_Y.ps.>2,0;

б) верификация псевдотуберкулеза: среднее значение оптической плотности раствора в реакции с порином из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) в 2 раза больше среднего значения оптической плотности раствора в реакции с порином из Y. enterocolitica (ОП_Y.е.) - ОПY.р5./ ОП_Y.е.>2,0;

в) верификация смешанной формы иерсиниозной инфекции: среднее значение оптической плотности раствора в реакции с порином из Y. enterocolitica (ОП_Y.е..) равно (или близко) среднему значению оптической плотности раствора в реакции с порином из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) - ОП_Y.е.=ОП_Y.ps., а ОП_Y.е./ОП_Y.ps. и ОП_Y.ps./ОП_Y.е. близки или равны 1,0.

Изобретение иллюстрируется следующим примером:

Полистироловый планшет (96-луночный полистироловый планшет фирмы «Dynatech», Швейцария или «Costar», США) сенсибилизируют антигенами, на одну половину планшета наносят видоспецифический белок-порин НМ Y. pseudotuberculosis, a на другую половину планшета - видоспецифический белок-порин НМ Y. enterocolitica в концентрации 5 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере с рН 9.0 каждого из антигенов и выдерживают при 37°С в течение - 2 час. Далее содержимое лунок удаляют сильным встряхиванием, и планшет промывают 3 раза буфером "В", состоящим из 0,02 М фосфатно-солевого буфера рН 7,4 (буфер "А") + 0,05% твин-20. Буфер "А" содержит: 5,68 г Na₂HPO₄ + 6,24 г NaH₂PO₄ + 11,2 г NaCl + 2 л Н₂O. При каждой стадии промывки планшета необходимо тщательно удалять остатки влаги из лунок постукиванием перевернутого планшета о фильтровальную бумагу.

Затем в каждую лунку планшета вносят по 300 мкл буфера "С", состоящего из фосфатно-солевого буфера рН 7,4 (буфер "А") + 0,1% твин-20, и планшет инактивируют в течение 16-18 часов при 4°С. После удаления инактивирующего раствора, в лунки планшета по два повтора для каждого антигена вносят по 100 мкл исследуемой сыворотки крови, положительных и отрицательных контролей в диагностических титрах, определенных для каждого антигена: 1:800 - для порина из Y, pseudotuberculosis и 1:1600 - для порина из Y. enterocolitica. Исследуемые сыворотки крови больных, положительные и отрицательные контроли разводят буфером "В". Планшет инкубируют 2 ч при 37°С, затем отмывают 3-5 раз по 5 мин от несвязавшихся компонентов буфером "В", тщательно удаляя остатки влаги из лунок.

Затем в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл конъюгата (меченные ферментом вторые общевидовые антитела) в рабочем разведении (1:1000) в буфере "С" и инкубируют 1,5 ч при 37°С, затем планшет отмывают, как описано выше, дополнительно ополоснув планшет дистиллированной водой. В лунки планшета вносят по 70 мкл субстрат-индикаторного раствора, содержащего 0,04% орто-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) и 10 мкл 33% H₂O₂ в расчете на 10 мл используемого буфера. Цитратно-фосфатный буфер готовят при смешивании 49,3 мл 0,2 М двузамещенного фосфорнокислого натрия (1,42 г на 50 мл H₂O) и 50,7 мл 0,1 М лимоннокислого натрия (2,1 г на 100 мл Н₂O). Планшет выдерживают 15-20 мин в темноте (для развития цветной реакции) при комнатной температуре, затем добавляют в каждую лунку по 30 мкл 0,5 М H₂SO₄ для остановки реакции. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность раствора при длине волны равной 492 нм. При постановке ИФА на планшете одновременно измеряют оптическую плотность раствора в лунках, содержащих контроли:

- контроль положительный (контроли специфического связывания с каждым из антигенов в двух параллелях) - 100 мкл сыворотки крови больного ирсиниозом и 100 мкл сыворотки крови больного псевдотуберкулезом (сыворотки с бактериологически подтвержденным диагнозом) + 100 мкл конъюгата + 70 мкл субстрат-индикаторного раствора + 30 мкл H₂SO₄;

- контроль отрицательный (с каждым из антигенов) - 100 мкл сыворотки крови здорового донора + 100 мкл конъюгата + 70 мкл субстрат-индикаторного раствора + 30 мкл H₂SO₄;

- контроль неспецифического связывания - 100 мкл буферного раствора + 100 мкл конъюгата + 70 мкл субстрат-индикаторного раствора + 30 мкл H₂SO₄.

Результат считают положительным, если величина, соответствующая отношению значения оптической плотности раствора в лунках со специфической сывороткой к значению оптической плотности раствора в лунках с нормальной сывороткой для каждого антигена больше или равна 2,1 [15].

Верификация иерсиниоза с учетом этиологии возбудителя при положительных значениях реакции осуществляется путем определения величин, равных отношению значений оптической плотности раствора при взаимодействии одной и той же сыворотки крови больного с антигеном из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) и с антигеном из Y. enterocolitica (ОП_Y.е.) - ОП_Y.ps./ОП_Y.е. или, наоборот, ОП_Y.е./ОП_Y.ps..

В случае, если эта величина больше или равна 2,0 (ОП_Y.ps./ОП_Y.е.≥2,0), то подтверждается псевдотуберкулезная этиология заболевания, и, наоборот, если ОП_Y.е./ОП_Y.ps.≥2,0, то этиологическим возбудителем иерсиниозной инфекции является Y. enterocolitica. В случае, если значения ОП_Y.ps. и ОП_Y.е. близкие или равные и значения отношений ОП_Y.ps./ОП_Y.е. и ОП_Y.е./ОП_Y.ps. соответственно близки или равны 1.0, то иерсиниозная инфекция обусловлена одновременно Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Диагностический набор на иерсиниозы (псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз) для проведения заявляемого способа с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на основе видоспецифических антигенов - порина наружной мембраны (НМ) Y. pseudotuberculosis и порина НМ Y. enterocolitica предназначен для одномоментного выявления специфических антител к поринам НМ Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica из одной пробы сыворотки крови человека и может использоваться в клинических и эпидемиологических исследованиях, а также службой крови.

Набор содержит все необходимые для проведения ИФА реагенты, кроме дистиллированной воды.

Состав набора:

1) планшет полистироловый 96-луночный (фирма «Dynatech» Швейцария или «Costar» США) с иммобилизованными антигенами (порины) из Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica в герметично закрытом пакете - 1 шт.;

2) фосфатно-солевой буфер (концентрированный раствор буфера для инактивации и отмывки планшета для разведения сывороток и конъюгата) - 2 флакона.

3) конъюгат (фракция общевидовых антител против суммарной фракции иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой хрена) - 1 флакон;

4) субстрат (орто-фенилендиамин, 4 мг) - 1 флакон;

5) цитратно-фосфатный буфер - 1 флакон;

6) отрицательные и положительные контроли (лиофильно высушенные образцы сывороток крови больных с подтвержденным диагнозом «псевдотуберкулез» и «кишечный иерсиниоз», сыворотки крови здоровых доноров) - 4 флакона;

7) детергент (твин-20 или твин-80) - 1 флакон;

8) перекись водорода (Н₂O₂, концентрированный раствор) - 1 флакон;

9) стоп-реагент (раствор 0,5 М серной кислоты, Н₂SO₄) - 1 флакон;

Набор рассчитан на 96 определений, включая контроли.

Приготовление реагентов для проведения анализа:

1. Буфер "А": содержимое 1-го флакона с концентратом фосфатно-солевого буфера (рН 7,4) (смесь солей: 0,02 М натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, 0,02 М натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного и 0,1 М натрия хлористого) необходимо растворить в 1 л дистиллированной воды.

2. Буфер "В" для отмывки планшета и разведения исследуемых сывороток крови больных, положительного и отрицательного контролей: К 1 л буфера "А" добавить 0,5 мл твин-20 (или твин-80) и получают буфер "В".

Предварительное разведение сывороток: исследуемые сыворотки крови больных, контрольные (положительные и отрицательные) сыворотки крови разводят буфером "В" до рабочего разведения.

3. Буфер "С" для инактивации планшета и разведения конъюгата: к 200 мл буфера "А" добавляют 0,2 мл твин-20 (или твин-80) и получают буфер "С".

4. Субстратная смесь готовится непосредственно перед употреблением. Для проведения реакции содержимое флакона с субстратом (4 мг орто-фенилендиамина) растворяют в 10 мл цитратно-фосфатного буфера (готового к употреблению) и добавляют 10 мкл 33% Н₂О₂.

5. Стоп-реагент (раствор 0,5 М H₂SO₄) готов к использованию.

Для повышения достоверности результатов анализа исследуемые и контрольные образцы сыворотки крови рекомендуются ставить для каждого антигена в дубликатах, используя для каждого образца сыворотки две лунки.

Проведение иммуноферментного анализа с помощью предлагаемого диагностического набора:

Предварительно готовый планшет с иммобилизованными антигенами (порин из Y. pseudotuberculosis и порин из Y. enterocolitica, каждый из которых нанесен на половину планшета) требуется проинактивировать.

1). Инактивация планшета (предотвращение неспецифического связывания антигена с антителами): вносят во все лунки по 300 мкл буфера "С" и инкубируют в течение ночи (16 ч - 18 ч) при 6-8°С. Буфер "С" состоит из фосфатно-солевого буфера с рН 7,4 (буфер "А") +0,1% твин-20 (или твин-80). Для приготовления буфера "А" необходимо растворить содержимое 1-го флакона (смесь солей: 0,02 М натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, 0,02 М натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного и 0,1 М натрия хлористого) в 1 л дистиллированной воды. Далее к 200 мл буфера "А" добавляют 0,2 мл твин-20 (или твин-80) и получают буфер "С" для инактивации планшета и для разведения конъюгата. Раствор не хранят.

2). Отмывка планшета: после инактивации удаляют содержимое лунок декантированием и промывают их 3-5 раз по 5 мин от несвязавшихся компонентов буфером "В". Для приготовления буфера "В" к 1 л буфера "А" добавляют 0,5 мл твин-20 (или твин-80) и получают раствор для отмывания планшета и разведения сывороток. При каждой промывке во все лунки добавляют по 300 мкл промывочного буфера "В". При декантировании необходимо тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием планшета в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

3). Нанесение по 100 мкл исследуемой сыворотки, положительного и отрицательного контролей для каждого антигена в двух параллелях: сыворотки наносят в диагностических титрах, определенных для каждого антигена (1:800 для порина из Y. pseudotuberculosis и 1:1600 для порина из Y. enterocolitica), в буфере "В", как описано выше.

4). Инкубирование планшета при 37°С в течение 2 часов.

5). По окончании инкубации содержимое лунок удаляют и планшет промывают тщательно 3 раза буфером "В".

6). Вносят во все лунки по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении: рабочее разведение (1:1000) готовится при растворении содержимого флакона (сухого препарата) в буфере "С".

7). Инкубирование планшета при 37°С в течение 1,5 часа.

8). По окончании инкубации из лунок удаляют содержимое и планшет промывают, как описано выше.

9). Нанесение субстратной смеси. Субстрат-индикаторный раствор готовится непосредственно перед употреблением: сухой препарат орто-фенилендиамина (4 мг, 1 флакон) растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера (рН 5.0) и добавляют 10 мкл 33% Н₂О₂. Для приготовления раствора цитратно-фосфатного буфера содержимое флакона (смесь солей) растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Перед нанесением субстрат-индикаторного раствора планшет ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

10). Во все лунки планшета вносят по 70 мкл субстратной смеси и инкубируют в темноте в течение 15-20 мин при комнатной температуре.

11). Во все лунки в той последовательности, как и субстратную смесь, добавляют по 30 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции.

12). Регистрация результатов реакции: измеряют оптическую плотность раствора ферментативной реакции в лунках при длине волны равной 492 нм.

Результат считают положительным, если величина, соответствующая отношению значения оптической плотности раствора в лунках со специфической сывороткой к значению оптической плотности раствора в лунках с нормальной сывороткой для каждого антигена больше или равна 2,1 [15].

Верификация иерсиниоза с учетом этиологии возбудителя при положительных значениях реакции осуществляется путем определения величин, равных отношению значений оптической плотности раствора при взаимодействии одной и той же сыворотки крови больного с антигеном из Y. pseudotuberculosis (ОП_Y.ps.) и с антигеном из Y. enterocolitica (ОП_Y.е.) - ОП_Y.ps./ОП_Y.е. или, наоборот, ОП_Y.е./ОП_Y.ps..

В случае, если величина отношения ОП_Y.ps./ОП_Y.е. больше или равна 2,0 (при ОП_Y.ps./ ОП_Y.е.≥2,0), то подтверждается псевдотуберкулезная этиология заболевания, и, наоборот, если ОП_Y.е./ОП_Y.ps.≥2,0, то этиологическим возбудителем иерсиниозной инфекции является Y. enterocolitica. В случае, если значения ОП_Y.ps. и ОП_Y.е. близкие или равные и значения отношений ОП_Y.ps./ОП_Y.е. и ОП_Y.е./ОП_Y.ps. соответственно близки или равны 1.0, то иерсиниозная инфекция обусловлена одновременно Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Учайкин В.Ф., Гордеец А.В., Бениова С.Н. Иерсиниозы у детей. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2005. 144 с.

2. Попова О.В., Шепелева Г.К., Шестокова И.В., Андреев И.В., Попова Т.И., Ющук Н.Д. Клинико-иммунологическая характеристика иерсиниозной инфекции. // Инфекц. болезни. 2006. Т.4. №3. С.51-55.

3. Ценева Г.Я. Иерсинии и иерсиниозы. СПб. Санкт-Петербург. 2006. 168 с.

4. Иерсиниоз. Методические рекомендации по эпидемиологии, клинике, диагностике, лечению и профилактике. МЗ СССР, четвертое Главное управление. 1985. 25 с.

5. Koroliuk A.M., Golovacheva S.N., Dulatova M.V. The choice of rational methods for determining antibodies to Yersinia enterocolitica. The agglutination reaction. // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1988. №9. P.45-47.

6. Бургасова О.А., Кулешова Л.Б., Ценева Г.Я. и др. Сравнительная оценка различных иммунологических реакций в диагностике псевдотуберкулеза. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиологии. 1996. №2. С.48-51.

7. Королюк A.M., Головачева С.Н, Дулатова М.В. Серологическая диагностика кишечного иерсиниоза. Конструирование стабильного эритроцитарного препарата для реакции непрямой гемагглютинации. // ЖМЭИ. 1990. №3. С.30-34.

8. Дулатова М.В., Антонов B.C., Головачева С.Н. и др. Опыт применения иммуноглобулинового эритроцитарного препарата для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиологии. 1992. №4. С.55-57.

9. Сбойчаков В.Б., Королюк A.M., Вербов В.Н. и др. Применение твердофазного иммуноферментного анализа для серодиагностики псевдотуберкулеза. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиологии. 1986. №7. С.83-86.

10. Granfors К., Ogasawara М., Hill J.L., Lahesmaa-Rantala R., Toivanen A., Yu DTY. Analisis of IgA antiboddies to lipopolisaccharide in Yersiniatriggered reactive artritis. // J. Infect. Dis. 1989. V.159. P.1142-1147. Патент US 4831126 А от 16.05.1989.

11. Богаутдинов З.Ф., Вылегжанина Е.С., Кузьмина В.Б., Астахова Т.С., Ниязов Y.Э., Шумилов К.В. Способ диагностики иерсиниозов. // Патент RU 2152037 С1 от 27.06.2000.

12. Малов И.В., Рубцов И.В., Ющенко Г.В., Леоненко В.В. Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов. // Патент SU 1767435 А1 от 10.07.1992.

13. Chart Н., Cheasty T. The serolodiagnosis of human infections with Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006. V.47. P.391-397.

14. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунологии. 1997. №6. С.92-96.

15. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б, Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. 228 с.

16. Вострикова О.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Гузев К.В., Вакорина Т.И., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.О. Структура и функция порообразующих белков бактерий рода YERSINIA. // Биоорган. химия. 2006. Т.32. №4. С.371-383.

17. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. М. 1962. С.30-66.