Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ БИОСИНТЕЗА ЦЕФАЛОСПОРИНА С

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству антибиотиков, и касается способа биосинтеза цефалоспорина С-основного сырья при получении 7-аминоцефалоспорановой кислоты - полупродукта в синтезе полусинтетических антибиотиков, таких как цефотаксим, цефтриаксон, цефазолин и др.

Известные способы биосинтеза цефалоспорина С осуществляются путем культивирования продуцента Acremonium chrysogenum в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей. Углеродсодержащие компоненты питательной среды (в первую очередь моно- и полисахариды) играют решающую роль в процессе антибиотикообразования, выполняя роль структурных элементов и источника энергии.

Известны способы биосинтеза цефалоспорина С, где в качестве источников углерода используют преимущественно сахарозу /пат. США №3926973, 1973 г., пат. США №3826729, 1973 г., пат. США №3816257, 1974 г., пат. Кореи №9104371, 1991 г./. Согласно другим данным/пат. Кореи №9604037, 1993 г., пат. Германии №4127648 С1, 1993 г./ в качестве источника углерода используют преимущественно глюкозу или глюкозо-фруктозную смесь. По данным пат. США №4533632, 1982 г., основным источником углерода является лактоза.

Недостатком перечисленных выше способов является использование в процессе биосинтеза достаточно дорогих видов источников углерода, получаемых в результате переработки растительного сырья.

Известно, что использование в качестве источников углерода полисахаридов - кукурузного или картофельного крахмала, значительно удешевляет среду в которой проводят биосинтез и активирует процесс антибиотикообразования цефалоспорина С /пат. США №3825473, 1971 г., пат. России №1605512, 1995 г./.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ биосинтеза цефалоспорина С, изложенный в пат. России №1605512, 1995 г. (прототип). Согласно прототипу культивирование продуцента Acremonium chrysogenum осуществляют в жидкой питательной среде, содержащей, мас.%: кукурузный крахмал (по редуцирующим веществам) 4,5-5,5; соевая мука 0,01-0,08; экстракт кукурузный 8-11; растительное масло 0,15-0,35; сернокислый аммоний 0,7-1,4; фосфорно-кислый калий однозамещенный 0,5-0,7; сернокислый магний 0,3-0,4; сернокислая медь 0,0017; сернокислый цинк 0,014-0,016; сернокислый марганец 0,002-0,004; сернокислое железо 0,003-0,006; пеногаситель 0,01-0,2, вода остальное и при соотношении массовой доли источников органического азота и массовой доли полисахаридов в среде 1:0,4-0,6. Процесс ферментации ведут на протяжении первых 30 ч до момента набора объемной доли влажной биомассы 15-25% при температуре 27-29°С, после чего проводят смену температурного режима и процесс биосинтеза ведут при 23-25°С. При этом активность культуральной жидкости на 140-150 ч роста составляет 20000-22000 Ед/мл.

Недостатками способа по прототипу являются.

1. Использование в процессе культивирования в жидкой питательной среде полисахаридов - кукурузного крахмала или кукурузной муки, которые относятся к трудноусваяемым источникам углерода, что выражается в большой длительности процесса биосинтеза -140-150 ч.

2. Недостаточно высокий уровень активности цефалоспорина С в культуральной жидкости (20000-22000 Ед/мл).

Целью заявляемого способа является.

- повышение активности цефалоспорина С в культуральной жидкости с 20000-22000 Ед/мл до 22500-24000 Ед/мл

- сокращение длительности процесса биосинтеза со 140-150 ч до 135-140 ч.

Поставленная цель в заявляемом способе достигается за счет выявленного в процессе исследований свойства культуры Acremonium chrysogenum образовывать в процессе биосинтеза цефалоспорин С с высокой активностью на жидких средах, содержащих в качестве источников углерода частично гидролизованный кукурузный или картофельный крахмал. Частично гидролизованный крахмал образуется в результате обработки крахмала комплексным ферментным препаратом амилосубтилин (товарные марки Г3х или Г10х). Амилосубтилин - комплексный ферментный препарат, продуцируемый микробной культурой Bacillus subtilis. Содержит в своем составе альфа-амилазу, нейтральную и слабощелочную протеазы - до 10 Ед/г, бета-глюконазу - до 250 Ед/г, целлюлазу - около 2 Ед/г, клиланазу - до 10 Ед/г. Амилосубтилин Г3х и Г10х стандартизуют по альфа-амилазе (3.2.1.1.альфа-1,4-глюканглюкогидролаза) до 600-1000 условных ед. для Г3х и 1000-3000 условных ед для Г10х. Расход 1-2 условных ед. на 1 г крахмала. Гидролиз крахмала амилосубтилином приводит к образованию из крахмала преимущественно смеси более низкомолекулярных олигосахаридов, что обеспечивает более легкое усвоение культурой данных углеродных компонентов, сокращению срока биосинтеза и увеличению уровня антибиотикообразования до 22500-24000 Ед/мл.

В процессе исследований установлено также, что оптимальной концентрацией ферментного гидролизата в процессе культивирования, обеспечивающей уровень активности 22500-24000 Ед/мл в культуральной жидкости на 135-140 ч, является массовая доля последнего 8-10% (в пересчете на крахмал). Уменьшение массовой доли гидролизата в питательной среде приводит к снижению уровня антибиотикообразования менее 22500 Ед/мл. Увеличение массовой доли гидролизата более 10% приводит к необоснованному росту стоимости питательной среды без дополнительного роста активности и не превышает описанный выше уровень 24000 Ед/мл.

Отличительные признаки заявляемого способа.

1. Использование в процессе культивирования культуры Acremonium chrysogenum на жидкой питательной среде гидролизатов кукурузного или картофельного крахмала, полученных путем обработки крахмала комплексным ферментным препаратом амилосубтилином.

2. Использование при культивировании культуры Acremonium chrysogenum крахмальных гидролизатов с массовой долей в питательной среде 8-10% (в пересчете на крахмал).

Заявляемый способ обеспечивает

1. Сокращение длительности процесса биосинтеза со 140-150 ч до 135-140 ч.

2. Увеличение активности культуральной жидкости с 20000-22000 Ед/мл до 22500-24000 Ед/мл.

3. За счет сокращения длительности процесса и увеличения активности достигается снижение энергетических затрат и снижение себестоимости готового продукта.

Следующие примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

ПРИМЕР 1

1 этап (получение ферментного гидролизата крахмала).

В аппарат для культивирования культуры Acremonium chrysogenum вместимостью 3,0 м³ заливают половину от расчетного количества воды, загружают при перемешивании 120 кг кукурузного или картофельного крахмала. Затем добавляют при перемешивании хлорид кальция из расчета 0,7 г на 1 кг крахмала (в пересчете на безводный продукт). Вносят комплексный ферментный препарат амилосубтилин Г3х со специфической активностью 600 Ед/г или Г10х со специфической активностью 3000 Ед/г из расчета 2 Ед/г крахмала (в пересчете на безводный продукт). Температуру в аппарате поднимают до (70±5)°С и выдерживают при данной температуре в течение 30 мин. Затем температуру быстро повышают до 110°С и выдерживают в течение 3-5 минут для инактивации фермента. Получают ферментный гидролизат крахмала. Полученный гидролизат используют в приготовлении питательной среды.

2 этап (приготовление питательной среды и ведение процесса биосинтеза).

Полученный на 1-м этапе гидролизат охлаждают до 60°С, загружают все необходимые компоненты и доводят до объема 1500 л водой. Массовая доля загруженных компонентов составляет,%:

1. Ферментный гидролизат кукурузного

(картофельного) крахмала

(в пересчете на крахмал) 8,0

2. Кукурузный экстракт 8,0

3. Соевая мука 0,085

4. Глюкоза 0,5

5. Мел 1,0

6. Сульфат аммония 1,7

7. Масло растительное 0,3

8. Калий фосфорнокислый

однозамещенный 0,7

9. Микроэлементы (суммарно) 0,715

10. Вода До 1500 л

После стерилизации среды в аппарат с питательной средой передают вегетативный посевной материал культуры Acremonium chrysogenum, имеющий величину водородного показателя 7,0 рН и объемную долю влажной биомассы 15%. Количество передаваемого посевного материала составляет 10% от объема питательной среды.

Процесс культивирования ведут при следующих параметрах: температура (28±1)°С от 0 до 35 ч, далее до конца процесса (25±1)°С. Аэрацию и перемещивание осуществляют в режиме максимальной интенсивности дыхания, поддерживая избыточное давление в аппарате (0,06±0,01) МПа, а парциальное давление растворенного кислорода не ниже 30% от насыщения. Величину водородного показателя поддерживают на уровне (6,0±0,1) рН путем дозирования аммиачной воды, раствора сульфата аммония и растительного масла. Дозирование раствора сульфата аммония осуществляют так, чтобы массовая доля аммонийного азота была в пределах (0,05±0,1)%. Дозирование растительного масла осуществляют так, чтобы парциальное давление растворенного кислорода было не ниже 30% от насыщения. Через 140 ч культивирования активность культуральной жидкости составляет 22500 Ед/мл.

ПРИМЕР 2

1 этап (получение ферментного гидролизата крахмала).

В аппарат для культивирования культуры Acremonium chrysogenum вместимостью 3,0 м³ заливают половину от расчетного количества воды, загружают при перемешивании 150 кг кукурузного или картофельного крахмала. Затем добавляют при перемешивании хлорид кальция из расчета 0,7 г на 1 кг крахмала (в пересчете на безводный продукт). Вносят комплексный ферментный препарат амилосубтилин Г3х со специфической активностью 1000 Ед/г или Г10х со специфической активностью 2000 Ед/г из расчета 2 Ед/г крахмала (в пересчете на безводный продукт). Температуру в аппарате поднимают до (70±5)°С и выдерживают при данной температуре в течение 30 мин. Затем температуру быстро повышают до 110°С и выдерживают в течение 3-5 минут для инактивации фермента. Получают ферментный гидролизат крахмала. Полученный гидролизат используют в приготовлении питательной среды.

2 этап (приготовление питательной среды и ведение процесса биосинтеза).

Полученный на 1-м этапе гидролизат охлаждают до 60°С, загружают все необходимые компоненты и доводят до объема 1500 л водой. Массовая доля загруженных компонентов составляет, %:

1. Ферментный гидролизат кукурузного

(картофельного) крахмала

(в пересчете на крахмал) 10,0

2. Кукурузный экстракт 8,0

3. Соевая мука 0,085

4. Глюкоза 0,5

5. Мел 1,0

6. Сульфат аммония 1,7

7. Масло растительное 0,3

8. Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,7

9. Микроэлементы (суммарно) 0,715

10. Вода До 1500 л

После стерилизации среды в аппарат с питательной средой передают вегетативный посевной материал культуры Acremonium chrysogenum, имеющий величину водородного показателя 7,2 рН и объемную долю влажной биомассы 15%. Количество передаваемого посевного материала составляет 10% от объема питательной среды.

Процесс культивирования ведут при следующих параметрах: температура (28±1)°С от 0 до 35 ч, далее до конца процесса (25±1)°С. Аэрацию и перемешивание осуществляют в режиме максимальной интенсивности дыхания, поддерживая избыточное давление в аппарате (0,06±0,01) МПа, а парциальное давление растворенного кислорода не ниже 30% от насыщения. Величину водородного показателя поддерживают на уровне (6,0±0,1) рН путем дозирования аммиачной воды, раствора сульфата аммония и растительного масла. Дозирование раствора сульфата аммония осуществляют так, чтобы массовая доля аммонийного азота была в пределах (0,05±0,1)%. Дозирование растительного масла осуществляют так, чтобы парциальное давление растворенного кислорода было не ниже 30% от насыщения. Через 135 ч культивирования активность культуральной жидкости составляет 24000 Ед/мл.

ПРИМЕР 3.

1 этап (получение ферментного гидролизата крахмала).

В аппарат для культивирования Acremonium chrysogenum вместимостью 3,0 м³ заливают половину от расчетного количества воды, загружают при перемешивании 135 кг кукурузного или картофельного крахмала. Затем добавляют при перемешивании хлорид кальция из расчета 0,7 г на 1 кг крахмала (в пересчете на безводный продукт). Вносят комплексный ферментный препарат амилосубтилин Г3х со специфической активностью 800 Ед/г или Г10х со специфической активностью 2500 Ед/г из расчета 2 Ед/г крахмала (в пересчете на безводный продукт). Температуру в аппарате поднимают до (70±5)°С и выдерживают при данной температуре в течение 30 мин. Затем температуру быстро повышают до 110°С и выдерживают в течение 3-5 минут для инактивации фермента. Получают ферментный гидролизат крахмала. Полученный гидролизат используют в приготовлении питательной среды.

2 этап (приготовление питательной среды и ведение процесса биосинтеза).

Полученный на 1-м этапе гидролизат охлаждают до 60°С, загружают все необходимые компоненты и доводят до объема 1500 л водой. Массовая доля загруженных компонентов составляет, %:

1. Ферментный гидролизат кукурузного

(картофельного) крахмала

(в пересчете на крахмал) 9,0

2. Кукурузный экстракт 8,0

3. Соевая мука 0,085

4. Глюкоза 0,5

5. Мел 1,0

6. Сульфат аммония 1,7

7. Масло растительное 0,3

8. Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,7

9. Микроэлементы (суммарно) 0,715

10. Вода До 1500 л

После стерилизации среды в аппарат с питательной средой передают вегетативный посевной материал культуры Acremoniurn chrysogenum, имеющий величину водородного показателя 7,2 рН и объемную долю влажной биомассы 15%. Количество передаваемого посевного материала составляет 10% от объема питательной среды,

Процесс культивирования ведут при следующих параметрах: температура (28±1)°С от 0 до 35 ч, далее до конца процесса (25±1)°С. Аэрацию и перемешивание осуществляют в режиме максимальной интенсивности дыхания, поддерживая избыточное давление в аппарате (0,06±0,01) МПа, а парциальное давление растворенного кислорода не ниже 30% от насыщения. Величину водородного показателя поддерживают на уровне (6,0±0,1) рН путем дозирования аммиачной воды, раствора сульфата аммония и растительного масла. Дозирование раствора сульфата аммония осуществляют так, чтобы массовая доля аммонийного азота была в пределах (0,05±0,1)%. Дозирование растительного масла осуществляют так, чтобы парциальное давление растворенного кислорода было не ниже 30% от насыщения. Через 138 ч культивирования активность культуральной жидкости составляет 23200 Ед/мл.