СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУММЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ КИСЛОТ ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ ПИХТЫ СИБИРСКОЙ (Abies Sibirica) ПУТЕМ ЭКСТРАКЦИИ БИНАРНЫМ ЭКСТРАГЕНТОМ

Изобретение относится к способам выделения биологически активной суммы природных соединений, конкретно к усовершенствованному способу выделения из древесной зелени пихты сибирской (Abies Sibirica) природной смеси тритерпеновых кислот, которая может быть использована в сельском хозяйстве для повышения продуктивности растений.

Известен способ получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот из древесной зелени (ДЗ) пихты (действующего вещества росто- и иммуностимулятора с/х растений «Новосил» [RU 2108803]). Способ предусматривает измельчение воздушно-сухой ДЗ пихты, экстракцию ее несмешивающимся с водой органическим растворителем (трет-бутилметиловым эфиром), отделение экстракта от хвои, обработку его водным раствором щелочного агента, разделение водно-щелочного и органического слоев, выделение из органического слоя суммы нейтральных изопреноидов, а из водно-щелочного слоя - суммы тритерпеновых кислот подкислением и экстракцией органическим растворителем. Выход целевого продукта суммы тритерпеновых кислот достигает 6.2% от веса сырья в зависимости от соотношения хвои и побегов в сырье. Недостатком способа является необходимость обработки экстракта агрессивным раствором щелочи, что снижает активность целевого продукта из-за изомеризации тритерпеновых кислот в менее активные формы. Последующая обработка кислотой требует отмывки экстракта, содержащего тритерпеновые кислоты, до нейтральных значений pH во избежание нежелательных реакций готового продукта.

Целью изобретения является упрощения процесса за счет сокращения технологической цепочки путем исключения из нее обработки щелочью и кислотой, влияющих на активность готового продукта.

Поставленная задача достигается тем, что высушенную и измельченную ДЗ пихты экстрагируют смесью углеводородного растворителя с полярным водорастворимым растворителем. Последующее разбавление экстракта водой (до 20% от объема) приводит к расслоению экстракта на неполярную часть, содержащую в основном неполярные компоненты, и полярную, обогащенную тритерпеновыми кислотами. При этом смоляные кислоты, не вносящие вклада в активность целевого продукта, в основном оказываются в неполярной части, что может дополнительно увеличить активность целевого продукта.

Изучена эффективность экстрагентов на основе смесей углеводородных растворителей с ацетоном, этанолом и изопропанолом и ростстимулирующая активность полученных экстрактов.

Отличие данного способа заключается в использовании двухкомпонентного экстрагента с различной полярностью входящих компонентов, что обеспечивает расслаивание экстракта при разбавлении водой без обработки щелочью и кислотой.

Пример 1. (Воспроизводит условия прототипа с целью характеристики используемого сырья и получения образца-эталона для биологических испытаний.) Воздушно-сухую и мелко измельченную древесную зелень пихты (100 г) заливают 0,2 л трет-бутил-метилового эфира и оставляют при комнатной температуре на 1 ч. Экстракт сливают, сырье заливают на 1 ч новой порцией (0,2 л) трет-бутил-метилового эфира. Экстракт сливают, объединяют с первой порцией экстракта и добавляют к нему 0,15 л 2%-ного водного раствора едкого натра. Полученную смесь энергично встряхивают в делительной воронке и оставляют расслаиваться. Через 15 мин нижний (водно-щелочной) слой сливают, к оставшемуся эфирному слою добавляют еще 0,1 л 2%-ного водного раствора едкого натра. После аналогичного встряхивания и расслоения водно-щелочной слой сливают, объединяют с первой порцией такого же раствора, подкисляют 10%-ной соляной кислотой до pH 2 (0,07 л) и добавляют трет-бутил-метиловый эфир (0.3 л). После энергичного перемешивания в делительной воронке и расслоения нижний (водный) слой отделяют, а верхний (эфирный) промывают 4 раза порциями по 0,1 л насыщенным водным раствором хлористого натрия, высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Получают 6,1 г целевого продукта в виде серо-зеленого порошка. Выход 6,1%. Таким образом, процесс включает 12 стадий.

Пример 2. Воздушно-сухую и мелко измельченную древесную зелень пихты (100 г) заливают 0,2 л смеси этанол : нефрас в соотношении 1:1 и оставляют при комнатной температуре на 1 ч. Экстракт сливают, сырье заливают на 1 ч новой порцией (0,2 л) смеси этанол: нефрас 1:1. Экстракт сливают, объединяют с первой порцией экстракта и добавляют к нему 0,06 л воды. После энергичного встряхивания в делительной воронке экстракт оставляют расслаиваться. После расслоения нижний (водный) слой отделяют и упаривают досуха. Получают 8,1 г целевого продукта в виде серо-зеленого порошка. Выход 8.1%.

Пример 3. Воздушно-сухую и мелко измельченную древесную зелень пихты (100 г) заливают 0,2 л смеси ацетон : нефрас в соотношении 1:1 и оставляют при комнатной температуре на 1 ч. Экстракт сливают, сырье заливают на 1 ч новой порцией (0,2 л) смеси ацетон : нефрас 1:1. Экстракт сливают, объединяют с первой порцией экстракта и добавляют к нему 0,06 л воды. После энергичного встряхивания в делительной воронке экстракт оставляют расслаиваться. После расслоения нижний (водный) слой отделяют и упаривают досуха. Получают 7.9 г целевого продукта в виде серо-зеленого порошка. Выход 7,9%.

Пример 4. Воздушно-сухую и мелко измельченную древесную зелень пихты (100 г) заливают 0,2 л смеси изопропанол : нефрас в соотношении 1:1 и оставляют при комнатной температуре на 1 ч. Экстракт сливают, сырье заливают на 1 ч новой порцией (0,2 л) смеси изопропанол:нефрас 1:1. Экстракт сливают, объединяют с первой порцией экстракта и добавляют к нему 0,06 л воды. После энергичного встряхивания в делительной воронке экстракт оставляют расслаиваться. После расслоения нижний (водный) слой отделяют и упаривают досуха. Получают 8,2 г целевого продукта в виде серо-зеленого порошка. Выход 8.2%.

Таким образом, выход продукта в примерах 2-4 повышается в 1.3 раза, а число стадий процесса сокращается до 4. Из процесса исключаются стадии обработки экстракта агрессивными жидкостями щелочью и кислотой.

Исследование эффективности применения целевого продукта по примерам 2-4, а также сравнительное исследование эффектов целевого продукта с препаратом Новосил на всхожесть и силу роста семян и показатели урожайности сельскохозяйственных культур (примеры 5-6) проведено совместно с ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет».

Пример 5. Лабораторные исследования по влиянию препарата на всхожесть и силу роста семян проводили методом рулонов. Семена смачивали 0,05% раствором стимуляторов роста из расчета 10 мл на 100 г семян. В контрольном варианте использовали воду. Раскладывали по 100 семян в рулон и проращивали неделю. Определяли всхожесть, массу и длину проростков, количество корешков на яровой пшенице сортов Кантегирская 89.

Схема опыта: 1. Контроль

2. Образец №1 - получен по примеру 2

3. Образец №2 - получен по примеру 3

4. Образец №3 - получен по примеру 1

5. Образец №4 - получен по примеру 4

Из таблицы видно, что по всхожести семена, обработанные препаратами практически не отличаются от контроля, масса и высота побега увеличилась по сравнению с контролем в вариантах 1 (пр. 2) и 2 (пр. 3). Число корней увеличилось по сравнению с контролем во всех вариантах опыта, кроме препарата-прототипа, соответствующего «Новосилу». Таким образом, препараты, полученные по примерам 2-4, не уступают препарату «Новосил» по влиянию на всхожесть и биометрические показатели проростков пшеницы.

Пример 6. Полевые опыты проводились на яровой пшенице сортов Новосибирская 22 на базе НГАУ в саду Мичуринцев. Почва серая лесная слабосмытая среднемощная тяжелосуглинистая на бескарбонатном тяжелом суглинке. Содержание гумуса - 4,5%, нитратов - 0,8 мг/100 г, фосфора - 11,8 мг/100 г, калия - 6,3 мг/100 г. Посев проводился вручную, из расчета 600 зерен на квадратный метр, 23 мая 2011 года. Повторность четырехкратная. Рендомизация по блокам. Обработка семян проводилась перед посевом путем смачивания 0,025% раствором препарата.

Схема опыта: 1. Контроль

2. Образец №1 - получен по примеру 2

3. Образец №2 - получен по примеру 3

4. Образец №3 - получен по примеру 1

5. Образец №4 - получен по примеру 4

Уборка урожая проводилась 15 августа по Доспехову [1]. Математическую обработку данных проводили по программе SNEDECOR [2].

1. Доспехов В.А. Методика полевого опыта. - М.: Колос, 1965, 351 с.

2. Сорокин О.Д. Прикладная статистика на компьютере. 2-е изд., Краснообск, ГУП РПО СО РАСХН, 2009, 222 с.

Из таблиц видно, что применение препаратов, полученных по способу-прототипу и заявляемому способу, увеличивает урожай на 25-34% и улучшает структуру урожая, а также увеличивает продуктивность растений по сравнению с контролем. Препараты, полученные по заявляемому способу в примерах 2-4, не уступают препарату «Новосил».

Пример 7. Проведен ВЭЖХ-анализ концентратов, полученных в условиях примеров 1-4 в условиях анализа препарата-прототипа [RU 2108803].