Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения экзополисахарида бактерий Ancylobacter abiegnus

Изобретение относится к экспериментальной биологии, медицине и ветеринарии. Может быть использовано для получения различных биологически активных веществ углеводной природы.

На протяжении нескольких десятилетий в современной микробиологии остается важной задача поиска новых микроорганизмов-продуцентов экзополисахаридов (ЭПС) с уникальными свойствами. Бактериальные ЭПС обладают широким спектром физико-химических, биологических и функционально-технологических свойств, благодаря чему они находят применение в ветеринарии, медицине, фармацевтической, пищевой, химической, нефтедобывающей и других отраслях народного хозяйства.

Особый интерес у исследователей представляют ЭПС малоизученных бактерий, таких как диссипотрофы. Эти микроорганизмы относятся к олиготрофам, обитают в ультрапресных условиях в Северных болотах России, участвуют в конечной стадии разложения древесины - сложного лигноцеллюлозного комплекса - и используют простые соединения, в частности сукцинат, оксалат, ксилозу и ряд других (Ancylobacter abiegnus sp. nov. – олиготрофный представитель микобактериального сообщества / М. В. Зайчикова [и др.] // Микробиология. – 2010. – Т. 79, № 4. – С. 483-490).

ЭПС бактерий-диссипотрофов не изучены. В литературе не содержится сведений об их выделении и свойствах.

Эти бактерии относятся к классу Alphaproteobacteria, отряду Rhizobiales, семейству Hyphobacteriaceae. Клетки бактерий Ancylobacter abiegnus кокковидной формы, плеоморфные, неподвижные, размером 0,65–0,9 мкм, имеют многочисленные фимбрии. По Граму окрашиваются отрицательно. Бактерии этого вида являются облигатными аэробами. Бактерии A.abiegnus Z-0056 - олиготрофы, они не растут на питательных средах с высоким содержанием субстрата, для их культивирования используются среды, содержащие простые органические соединения в небольших концентрациях. Источниками углерода и энергии для них являются органические кислоты: ацетат, глюконат, малат, сукцинат, цитрат, оксалат, а также ксилан и ксилоза. Не используют С1-соединения, моно- и дисахариды, аминокислоты. Кроме того, эти бактерии относятся к ацидофилам и растут в строгом интервале рН среды 5,0-5,5. Оптимальная концентрация субстрата в среде – 0,25 г/л. Для роста необходим дрожжевой экстракт (0,05 г/л). Для выделения ЭПС культуры A.abiegnus Z-0056 выращивали на жидких ультрапресных минеральных средах с сукцинатом (0,1%) в качестве субстрата (Ancylobacter abiegnus sp. nov. – олиготрофный представитель микобактериального сообщества / М. В. Зайчикова [и др.] // Микробиология. – 2010. – Т. 79, № 4. – С. 483-490; Зайчикова М.В. Диссипотрофные бактерии ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах / дис.: канд. биол. наук / М. В. Зайчикова. – Москва, 2011. – 113 с.; Cohen-Bazire G. Kinetic studies of pigmen tsynthesis by non-sulphur purple bacteria / G. Cohen-Bazire, W.R. Sistrom, R.Y. Stanier // Journal of Comparative Physiology. – 1957. – V. 49. – Р. 25 - 68):

Среда МСО: на 1 л: 1 мл основы АТСС; 1 г сукцината; 0,1 г дрожжевого экстракта; 0,250 г (NH₄)₂SO₄; 0,071 г KH₂PO₄; 1 мкл витаминов, рН 5,5-5,6.

Основа АТСС: модифицированные соли Хартнера, MgSO₄·7H₂O – 29,7 г; CaCl₂·2H₂O – 3,34 г, NH₄MoO₄ – 9,25 г, FeSO₄·7H₂O – 99,0 мг; раствор микроэлементов – 50,0 мл ; H₂O – 1000 мл.

Раствор микроэлементов: ЭДТА – 0,25 г; ZnSO₄ – 1,1 г; FeSO₄·7H₂O – 0,5 г; MnSO₄·H₂O – 0,15 г; CuSO₄·5H₂O – 0,04 г; CoCl₂·6H₂O – 20,8 г.

Витамины: биотин – 20 мг, фолиевая кислота – 20 мг, тиамин – 25 мг, пантотен – 25 мг, В₁₂ – 1 мг, рибофлавин – 25 мг, никотинамид – 25 мг, n-аминобензойная кислота – 25 мг, бензоатная кислота – 25мг, пиридоксин – 20 мг, этанол (70%)– 100 мл.

За основу способа выделения был взят способ Cerning J. (Cerning J. Polysaccharides exocellulaires produits par les bactéries lactiques / J. Cerning, I.H. Roissart, F.M. Luquet // Bactéries Lactiques, Grenoble, France. – 1994. – P. 309 - 329). Он не учитывает тот факт, что клетки бактерий A.abiegnus Z-0056 окружены многочисленными фимбриями, что затрудняет выделение экзополисахарида. Этот способ в модификации впервые применяется для выделения ЭПС A.abiegnus Z-0056.

Технической задачей изобретения является выделение ЭПС A.abiegnus Z-0056 из культуральной жидкости после выращивания микроорганизмов.

Поставленная задача решается в способе получения экзополисахарида бактерий Ancylobacter аbiegnus, заключающемся в выделении экзополисахаридов из культуральной жидкости этих бактерий, при котором культуральную жидкость упаривают на роторном испарителе, после чего бактериальную взвесь неоднократно пропускают через шприц с диаметром иглы 0,06 мм, затем центрифугируют при 10000 g и осаждают тремя объемами 96% этанола, отстаивают в течение 12 ч при температуре 4°С, снова центрифугируют при 2500 g, суспендируют полученный осадок в 96% этаноле, центрифугируют при 2500 g, высушивают на воздухе, после чего растворяют осадок в дистиллированной воде, центрифугируют при 2500 g, осадок повторно растворяют в дистиллированной воде, осаждают тремя объемами этанола, после чего полученный ЭПС растворяют в воде и лиофильно высушивают.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Бактерии A.abiegnus Z-0056 выращивали при температуре 25°С на среде МСО в колбах по 100 мл среды при встряхивании на «Шейкер-инкубаторе ES-20» (Литва). Посевным материалом служит культура, выращенная на том же субстрате и отобранная в логарифмической фазе роста в объеме 5 мл. Рост бактерий контролировали по оптической плотности (длина волны – 425 нм). Измерения проводили на cпектрофотометре «Cary 100 Scan» (Varian, США). Метод выделения ЭПС состоял из следующих этапов. Сначала культуральную жидкость упаривали на роторном испарителе, после чего неоднократно пропускали через шприц с диаметром иглы 0,06 мм. Это связано с тем, что ЭПС данной культуры локализуется вокруг клетки в виде слизи, а клетка окружена многочисленными фимбриями, которые и затрудняют выделение биополимера. Затем центрифугировали при 10000 g и осаждали 3 объемами 96% этанола, отстаивали в течение 12 ч при температуре 4°С. Затем центрифугировали при 2500 g, суспендировали полученный осадок в 96% этаноле, центрифугировали при 2500 g, высушивали на воздухе. После чего растворяли осадок в дистиллированной воде, центрифугировали при 2500 g, осадок повторно растворяли в дистиллированной воде, осаждали 3 объемами этанола, после чего полученный ЭПС растворяли в воде и лиофильно высушивали.

Полученный ЭПС представлял собой порошок белого цвета, не имеющий запаха, не содержащий белка, нуклеиновых кислот и клеток продуцента. ЭПС A.abiegenus Z-0056 был условно назван нами анцилан.

Количество анцилана было равно 0,30 ± 0,01 г/л культуральной жидкости.

В результате проведенных исследований нами был выделен ЭПС из диссипотрофных бактерий A.abiegnus Z-0056. Заявляемый способ получения ЭПС A.abiegnus Z-0056 впервые используется для этих бактерий.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение экзополисахаридов из культуральной жидкости A.abiegnus Z-0056 после выращивания микроорганизмов, которые могут быть использованы для получения различных биологически активных веществ углеводной природы.