Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к фармации и медицинской промышленности и касается создания биологически активного экстракта из корня молочая Фишера.

В последнее десятилетие вследствие возрастающего эколого-социального прессинга отмечается существенное снижение общей сопротивляемости организма, связанное с депрессией адаптационно- компенсаторных механизмов. В настоящее время актуальность проблемы профилактики расстройств иммунной системы с помощью иммунокорригирующих средств несомненна. Перспективным направлением иммунофармакологии представляется поиск иммуномодуляторов среди средств растительного происхождения, поскольку они имеют ряд преимуществ перед синтетическими: мягкое иммуномодулирующее действие, низкую токсичность, активацию функций не только иммунной, но и нервной и эндокринной систем благодаря наличию комплекса биологически активных веществ [8, 17].

Объектом настоящего исследования явился сухой экстрат молочая Фишера (Euphorbia Fischeriana, Euphorbia Pallasii tures L.). На территории России молочай Фишера произрастает в степях Забайкалья (Читинская область) и Восточной Сибири. Молочай Фишера давно и с успехом применяется в народной медицине, эффективность его препаратов объясняется богатым химическим составом: наличием флавоноидов, сапонинов, гликозидов, селена, аскорбатов, лактонов, обеспечивающих бактерицидное, противовоспалительное, противоопухолевое действие [6, 13]. Известно, что настой и отвар из корня молочая Фишера обладают многонаправленным терапевтическим действием и в медицинской практике их применяют для лечения импотенции, аденомы простаты, туберкулеза, анемии, сепсиса, эндометриоза, миомы матки, воспаления (1, 6, 17).

Таким образом, по данным народной и научной медицины препараты из корненей молочая Фишера обладают выраженным антиоксидантным и противовоспалительным действием, что указывает на целесообразность применения его в качестве иммуномодулирующего средства.

Наличие факторов токсичности - смол и эуфорбона, вызывающих выраженные кишечные расстройства (геморрагическую диарею), (17) ограничивает его использование и является основным препятствием для создания безопасного лечебного средства. В тибетской медицине для «очищения» корней молочая использовали бульон из мяса козы, молоко, либо раствор миробалана, в которых кипятили корни растения (10).

В настоящее время известны различные способы получения экстрактов из растительного сырья. Например, способ, заключающийся в перемешивании измельченного сырья с касторовым маслом при соотношении 1:1 к количеству экстрактивных веществ и обработке ультразвуком с частотой 19-22 Гц, интенсивностью 1,5-2,3 Вт в течение 1-8 часов при температуре 30-35°С, затем охлаждении до 18-20°С, добавлении хладона 11 и экстракции в течение 1,5-2 часов, при этом растворители берутся в соотношении (15-20):(75-80) (2).

Кривошеевой с соавторами, (5) двумя способами получены экстракты корней молочая Палласа и оценена их антиоксидантная активность. Первый экстракт (1) получен холодным спиртовым экстрагированием после трехкратной очистки ацетоном от смолистых веществ, обладающих раздражающим действием на слизистую желудочно-кишечного тракта. Второй экстракт (2) получен методом горячей спиртовой экстракции с предварительной трехкратной обработкой ацетоном и горячим хлороформным извлечением в вакууме. Установлено, что антиоксидантный эффект при 30 минутной гипоксии наиболее выражен у экстракта молочая Палласа, полученным 1 способом, а при летальной гипоксии - у экстракта молочая Палласа, полученным 2 способом. Антигипоксический эффект достоверно выше у экстракта молочая Палласа, полученным 2 способом. Как считает автор, второй способ экстракции более эффективен, поскольку позволяет выделить гликофосфолипиды, обеспечивающие антиоксидант-ную и антигипоксическую защиту (5).

Однако эти способы имеет следующие недостатки:

- применение в качестве экстрагентов липофильных органических растворителей не позволяет максимально удалить смолы;

- трудоемкость и сложность технологического процесса;

- использование дорогостоящих экстрагентов и оборудования.

За прототип для заявляемого объекта выбран способ получения биологически активного экстракта из растительного сырья (6). Результат данного метода достигается тем, что экстрагирование растительного сырья производят путем трехкратной обработки ацетоном при соотношении сырья и растворителя 1:1,0-1,2 в течение 60-80 минут при 20-25°С с промывкой каждой из порций водой до нейтральной среды, высушиванием сырья и дальнейшей однократной обработкой хлороформом при соотношении сырья и растворителя 1:1,5-1,7 в течение 180-200 минут при 20-25°С, после экстрагирования осуществляют сгущение экстракта, обработку этанолом производят при концентрации 30±1% и температуре этанола 70±4°С в течение 180-200 минут, а после очистки полученный экстракт подвергают деалколизации.

По сравнению с прототипом в предлагаемом способе экстрагирование проводят в козьем бульоне, что позволяет максимально удалить смолы, (таблица) содержащие антрагликозиды и алкалоиды, которые обладают сильным раздражающим действием на слизистую желудочно-кишечного тракта. Последующая обработка этанолом способствует более эффективному извлечению фосфолипидов, а использование процесса высушивания позволяет деалколизировать экстракт.

Техническим результатом изобретения является получение комплекса биологически активных веществ, присутствующих в растениях рода Молочай, обогащенных полифенольными соединениями, с высокой Р-витаминной и антиоксидантной активностью, без токсического и раздражающего действия на организм.

Результат изобретения достигается тем, что экстрагирование растительного сырья (корни молочая Фишера) производят путем однократной обработки козьим бульоном при соотношении сырья и растворителя 1:15 в течение 120-минут при 100°С, высушиванием сырья и дальнейшей трехкратной обработкой 50% этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент, равном 1:16 в течение 60, 60 и 30 минут, соответственно. Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа.

Целью изобретения является повышение иммуномодулирующей активности средства за счет более высокого содержания действующих веществ (терпеноидов, флавоноидов, оксикоричных кислот,) без токсического и раздражающего действия.

Для достижения указанной цели растительный материал (сырье) - 1000 г корненей молочая Фишера экстрагируют в бульоне (1:15), приготовленном из мяса козы, в течение 2 часов. Сырье отфильтровывают и сушат. Высушенное сырье измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83) и экстрагируют 50% этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент, равном 1:16 (с учетом коэффициента водопоглощения), при температуре 60°С и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом и 2-ом контактах фаз - 60 мин, при 3-ем контакте фаз - 30 мин. Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 270.0 г готового продукта, что составляет 27.0±0.5% от массы воздушно-сухого сырья.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, сухой экстракт, представляющий собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и сладковатым вкусом, с содержанием влаги - не более 5%.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример

Растительный материал (сырье) - 1000 г корней молочая Фишера экстрагируют в бульоне (1:15), приготовленном из мяса козы, в течение 2 часов. Сырье отфильтровывают и сушат. Высушенное сырье измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито №30 ГОСТ 214-83) и экстрагируют 50% этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент, равном 1:16 (с учетом коэффициента водопоглощения), при температуре 60°С и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом и 2-ом контактах фаз - 60 мин, при 3-ем контакте фаз - 30 мин. Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 270.0 г готового продукта, что составляет 27.0±0.5% от массы воздушно-сухого сырья. Получают 270.3 г готового продукта, что составляет 27.06% от массы воздушно-сухого сырья. Экстракт сухой представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и сладковатым вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.05%.

Острая токсичность растительного экстракта сухого (РЭС) определялась на белых беспородных мышах-самцах с исходной массой 20.0±1.0 г при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введениях растворенного в воде экстракта. Каждую дозу экстракта испытывали на 10 животных. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней. Регистрировали наблюдаемые признаки интоксикации, проводили вскрытие и осмотр погибших животных. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении больших доз экстракта сухого белым мышам наблюдаются признаки интоксикации, выражающиеся в замедлении ориентировочной реакции, резких движениях, появлением тонических, а затем тонико-клонических судорог. Животные погибали при явлениях сердечнососудистой недостаточности преимущественно в течение суток от введения экстракта сухого. LD50 по Керберу при внутрибрюшинном введении экстракта сухого 1960±60.76 мг/кг. При внутрижелудочном введении данного средства в максимально возможной дозе, гибель животных не регистрировалась, и не наблюдалось явных признаков интоксикации. Эти данные позволяют отнести испытуемый экстракт сухой к группе малотоксичных веществ по классификации Сидорова (15).

Определение иммуномодулирующих свойств экстракта сухого молочая Фишера в отношении показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа

Эксперименты проведены на мышах-самцах линии F₁ (СВАхС57 В1/6) массой 18-20 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая».

Действие исследуемого средства на показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной цитостатиком циклофосфаном, который вводили контрольной группе животных в дозе 250 мг/кг однократно внутрибрюшинно.

Экстракт молочая Фишера вводили опытной группе мышей на фоне циклофосфана в дозе 200 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней. Интактная и контрольная группы животных получали воду очищенную по аналогичной схеме. Исследования проводили на 15 день эксперимента.

Действие испытуемого средства на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике [14]. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1% взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4 сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена - 50 мкл 50% взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 часа по разнице масс опытной и контрольной лап.Индекс реакции ГЗТ (И_р) рассчитывали по формуле: И_р=[(М_оп-М_к)/М_к]×100%, где М_оп - масса опытной лапы, М_к - масса контрольной лапы.

Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству анти-телообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по A.J.Cunningham (1965). Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2x10⁸ клеток на мышь. Реакцию ставили на 5-е сутки после иммунизации [19].

Состояние макрофагального звена иммунного ответа оценивали в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши. Оптическую плотность лизата клеток перитонеального экссудата, отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными макрофагами, определяли на спектрофотометре «CECIL-2011» при длине волны 620 нм [14].

Полученные результаты обработаны статистическим методом с помощью критерия t-Стьюдента.

При исследовании влияния экстракта молочая Фишера в дозе 200 мг/кг на процессы антителообразования установлено, что данное средство восстанавливает показатели гуморального иммунного ответа в условиях циклофосфановой иммуносупрессии. Введение циклофосфана приводило к снижению как абсолютного числа АОК, так и числа АОК на 106 спленоци-тов на 35% и 39%, соответственно, по сравнению с теми же показателями в интактной группе. При введении исследуемого средства на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов; при этом первый показатель превышал уровень циклофосфановой супрессии в 1,6 раза, а второй - в 1,5 (Таблица 1).

При исследовании влияния экстракта молочая Фишера на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что испытуемое средство восстанавливает индекс данной реакции (ИР ГЗТ) в условиях циклофосфановой иммуносупрессии. Введение циклофосфана приводило к снижению ИР ГЗТ на 32% по сравнению с тем же показателем в интактной группе. При введении испытуемого средства на фоне иммунодепрессии наблюдали увеличение ИР ГЗТ в 1,7 раза по сравнению с контролем (Таблица 2).

При исследовании влияния экстракта молочая Фишера на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов на фоне циклофосфана установлено, что данное средство восстанавливает фагоцитарный индекс.Введение циклофосфана приводило к снижению фагоцитарного индекса на 45% по сравнению с тем же показателем в интактной группе. При введении исследуемого средства животным с иммунодефицитом наблюдали увеличение фагоцитарного индекса в 1,8 раза по сравнению с данными в контрольной группе (Таблица 3).

Таким образом, исследование иммуномодулирующих свойств экстракта молочая Фишера выявило его эффективность по отношению к реакциям клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа при экспериментальном иммунодефиците, вызванном цитостатиком циклофосфаном. Экстракт молочая Фишера в дозе 200 мг/кг способен ослаблять супрессивное действие циклофосфана на клеточно-опосредованную иммунную реакцию, антителогенез и фагоцитоз макрофагов.

Методом ВЭЖХ в экстракте сухом установлено наличие шести маркерных компонентов, таких как антикворин, энт-атизан-3β,16α,17-триол, -энт-16α,17-дигидроксиатизан-3-он, каураноевая кислота, джолкинолид В, джолкинолид А (рис.).

Аналитически сравнивали содержание дитерпенов до и после экстракции различными экстрагентами (козий бульон и раствор миробалана). Установлено, что использование козьего бульона в качестве экстрагента, позволило максимально удалить смолы, (таблица 4) содержащие антрагли-козиды и алкалоиды, обладающими сильным раздражающим действием на слизистую желудочно-кишечного тракта (16).

Проводили качественный и количественный анализ фенольных производных -рутина - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Gilson с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «МультиХром» для Windows. В качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку размером 4,6×250 мм PLATINUM EPS С 18 100, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза состояла из смеси растворителей метанол-вода-фосфорная кислота, концентрированная в соотношении 400:600:5. Скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, температура 20-23°С. Продолжительность хроматографирования 150 мин. Детектирование производили на УФ-детекторе Gilson при длине волны 254 нм. В качестве стандартных образцов использовали хроматографически чистые вещества: рутин - ФС 42-2508-87, ВИЛАР - ТУ 9369-141-048668244-02. Время удерживания рутина на колонке составило 1109 с, количественное соотношение флавоноидов в сырье, (в корнях молочая Фишера) в пересчете на рутин составило 1,83±0,13%.

Методика количественное определение флавоноидов.

Около 0.05 г (точная навеска) экстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в 10 мл теплой воды (40-60°С), прибавляют 5.2 мл 96% спирта, доводят объем раствора до метки водой (раствор А). 3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% спирте, доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор состоящий из 3 мл раствора А, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность государственного стандартного образца (ГСО) рутина. 1 мл приготовленного раствора ГСО рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Раствором сравнения является раствор, состоящий из 1 мл ГСО рутина, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин абсолютно сухой экстракт в процентах (X) рассчитывают по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора ГСО рутина;

m - масса экстракта в граммах;

m_o - масса ГСО рутина в граммах;

W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах. Примечание. Приготовление раствора ГСО рутина: около 0.05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено: 6.02±0.18%.

Для выявления оптимальных технологических режимов нами были изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительного сырья: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и количество экстракций.

Количественная оценка проводилась по выходу экстрактивных веществ (4, 5) и суммы флавоноидов. Метрологические характеристики представлены в таблице 5.

В качестве экстрагентов были использованы вода и этиловый спирт различных концентраций (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96%).

Как видно из таблицы 6, 50% спирт является оптимальным экстрагентом, так как позволяет добиться максимального выхода суммы флавоноидов с учетом выхода экстрактивных веществ.

Выявление оптимальной степени измельчения сырья проводили отдельно для каждого вида сырья. Количественную оценку проводили по выходу экстрактивных веществ. На основании полученных данных (таблица 7) и с учетом того, что слишком мелкое измельчение растительного материала ведет к загрязнению извлечения труднофильтруемыми высокомолекулярными соединениями, измельчение сырья следует проводить не более 3 мм.

В связи с тем, что в исходном растительном сырье содержатся термолабильные вещества, изучение влияния температуры на процесс экстракции проводили в интервале температур от 20 до 60°С. Данные представлены в таблице 8, оптимальная температура - 60±5°С.

При изучении влияния соотношения сырье-экстрагент на процесс экстракции установлено (таблица 9), что с увеличением количества экстра-гента возрастает выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов, но рост этот для соотношений 1:15 и выше незначителен, поэтому для предотвращения дополнительного расхода экстрагента выбрано соотношение равное 1:(16) (с учетом коэффициента водопоглощения).

Для определения продолжительности и необходимого количества экстракций установлено время достижения равновесных концентраций экстрактивных веществ и флавоноидов в системе сырье-экстрагент в ходе трехкратной экстракции. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 40% этиловым спиртом в соотношении 1:14 на водяной бане при температуре 60°С и постоянном перемешивании в колбе с обратным холодильником. Извлечения, полученные через определенные промежутки времени (15, 30, 45, 60, 75, 90 мин) в процессе трех экстракций, анализировали на содержание экстрактивных веществ и флавоноидов. Установлено, что равновесные концентрации устанавливаются при 1-ом и 2-ом контактах фаз через 60 мин, при 3-ем контакте фаз через 30 мин (таблица 10). Трехкратная экстракция обеспечивает достаточно полное истощение сырья - извлекается до 96% действующих веществ.

Таким образом, определены оптимальные условия получения экстракта сухого молочая Фишера, при которых достигается максимальное извлечение действующих веществ. Экстрагент для удаления дитерпенов-козий бульон, размер частиц сырья 3 мм, экстрагент 50% этиловый спирт; соотношении сырье: экстрагент, равном 1:16, температура экстракции 60°С, время экстракции при 1-м и 2-м контактах фаз - 60 мин, при 3-м контакте фаз - 30 мин.

Предложенный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получать продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты.

Таким образом, экстракт из корня молочая Фишера, приготовленный предлагаемым методом, нетоксичен, имеет высокое содержание веществ с Р-витаминной и иммуномодулирующей активностью. Предлагаемый способ позволяет получить комплекс биологически активных веществ, присутствующих в растениях рода Молочай, обогащенных полифенольными соединениями с высокой иммуномодулирующей активностью.

Источники информации

1. Буданцева А.А. Дикорастущие полезные растения России. / А.А.Буданцева // СПб., Изд. СПХФА, 2001. - 663 с.

2. Вецванг А.А., Г.В. Авраменко, А.Э. Чиксте, М.В. Огилец, У.Э. Браслиньш, А.И. Борисенокова. Способ получения экстрактов из растительного сырья А.с. №1337399, МКИ A61K 35/78, 1987. / - №4651734/30-14; опубликовано 19.12.1988 г.

3. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

4. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.

5. Кривошеева Е.М., Сердцев М.И., Кохан СТ. Антиоксидантная и анти-гипоксическая активность экстрактов из корня молочая Палласа, приготовленных разными способами // Электронный сборник научных трудов "Здоровье и образование в XXI веке". 2008. Т. 10. №12. С. 507-508.

6. Кривошеева Е.М, Кохан С.Т., Белозерцев Ю.А., Сердцев М.И., Намоконов Е.В. Способ получения биологически активного экстракта из корня Молочая Палласа / №50656000/14. Заявлено 13.10.1992. Опубликовано 27.11.2010. Бюл. 33. - 18 с.

7. Лекарственные растения Забайкалья: методические рекомендации / Б.И. Дулепова и др. Чита, 1991.

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М., 2008. - 1200 с.

9. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств. - М., 1990. - 57 с.

10. Чойжамц. «Онцар гадон дэр дзод». Тибетский медицинский трактат. Издательство: Наука, 1989 г. - 160 стр.

11. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище. Методологические указания. - М.,1999. - 87 с.

12. Перцов С.С. Язвенные поражения желудка у крыс Август и Вистар при остром и эмоциональном стрессе // Бюл. эксп. биол. и медицины. - 1995. - №11. - С. 469-473.

13.Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. В 6 т. Т. 2. Семейства Actinidiaceae - Malvaceae, Euphorbiaceae - Halorogaceae. / сост. Беленовская Л.М., Лесиовская Е.Е., Бобылева Н.С.- СПб., М, 2009. - 513 с.

14. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятяна - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

15. Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах ведения // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М. - 1973. - Вып. 13. - С. 47-51.

16. Судаков К.В. Нормальная физиология / К.В.Судаков // М.: МИА, 1999, - С. 193-197.

17. Телятьев В.В. Целебные клады Центральной Сибири. - Иркутск. 2000. - 235 с.

18. Сумати Праждня. Большой рецептурник Агинского дацана. Ксилограф Агинского дацана. - Нач. ХХ в. - 151 л. Рукопись, перевод Дашиева Д.Б.

19. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. - 1965. - Vol. 207. - №5001. - P. 1106-1107.