СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ТИРЕОТРОПНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Известно, что увеличение заболеваний щитовидной железы связано с геохимическими, социальными, экологическими и другими факторами [Архипова, 2012]. Щитовидная железа является не только одним из самых крупных эндокринных органов по своим размерам и массе, но и одним из наиболее значимых с позиций роли для организма секретируемых гормонов - йодтиронинов. В наибольшей степени на частоту тиреоидной патологии влияет уровень потребления йода населением. Во всем мире дополнительным средством профилактики является йодирование пищевой поваренной соли, а также назначение таблетированных препаратов йода наиболее уязвимым слоям населения (дети, беременные и кормящие женщины). В России более 30% территории, где почти у 80% населения наблюдается массовое поражение щитовидной железы, в основном, это эндемический зоб. По мировой статистике различными заболеваниями щитовидной железы (повышенная или пониженная функция железы, узловые образования) страдают не менее 3% населения. Известно, что недостаточное содержание в организме тиреоидных гормонов приводит к расстройству структурно-функциональных взаимосвязей нервной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем [Захария, 1997; Приходько 1976]. Гормоны щитовидной железы крайне необходимы для роста тканей, в процессах закладки и функционировании мозга, формировании интеллекта, регуляции и поддержании обмена веществ. Фармакологическая коррекция гипотиреоидного состояния организма основана на восполнении дефицита йода и тиреоидных гормонов. Несмотря на обширный арсенал современных лекарственных средств с тиреотропным действием, применяемых для лечения заболеваний щитовидной железы, необходимость в эффективных и безопасных средствах сохраняется. Учитывая клинические проявления, при гипотиреозе целесообразно использовать комплексный подход в лечении, целью которого является не только нормализация тиреоидного гормонального статуса, но и улучшение состояния нейровегетативной, сердечно-сосудистой, иммунной систем, коррекцию когнитивных нарушений и эмоционально-аффективных расстройств. При комплексном лечении больных с указанным профилем расстройств назначают эффективную седативную и метаболическую терапию. Для этой цели используют седативные препараты растительного происхождения, анаболические препараты, транквилизаторы, преимущественно бензодиазепинового ряда, антидепрессанты. Используемые препараты не всегда отличаются достаточной клинической эффективностью и при длительном применении могут вызывать побочные эффекты. В связи с этим оправдан значительный интерес к поиску новых средств, способных предупреждать и корригировать гипофункцию щитовидной железы.

Наряду с этим, учитывая зависимость ментальных процессов и клинических проявлений гипотиреоза от уровня тиреоидных гормонов в крови, развития вторичного иммунодефицита, целесообразными представляются вопросы коррекции патологических проявлений гипотиреоза средствами, обладающими иммуномодулирующим (татарник, крапива, репешок, череда) [Растительные, 2008; Растительные, 2009; Растительные, 2012] антиоксидантным (грецкий орех, цикорий, лещина, ряска) [Растительные, 2008; Растительные, 2009; Растительные, 2012; Растительные, 2013; Растительные, 2014; Fukunda, 2003], кроме того, череда, репешок, тарарник и дурнишник содержат экдистероиды которые, в свою очередь, обладают адаптогенным и анаболическим действием. [Harmatha, 2007]. Объектом исследования служило комплексное растительное средство (в дальнейшем экстракт), состоящее из листьев грецкого ореха, листа лещины, листьев репешка, надземной части череды, надземной части дурнишника колючего, листьев крапивы, надземной части ряски, корней цикория, надземной части татарника в соотношении 18, 16, 15, 14, 12, 8, 7, 5, 5% соответственно и его влияние на течение экспериментального гипотиреоза. В экстракте основными действующими компонентами являются грецкий орех, лещина, репешок, череда, дурнишник, а цикорий, ряска, крапива и татарник усиливают и модулируют действие основных компонентов.

В качестве прототипа использовали ламинарию в таблетках («Эвалар», Россия) в дозе 3 мг/кг, которая компенсирует суточную норму йода на 133% (согласно аннотации к препарату).

Технический результат изобретения - расширение ассортимента лекарственных средств растительного происхождения, имеющих надежную и обеспеченную сырьевую базу и корректирующих нарушения функций щитовидной железы, влияя на основные звенья патогенеза заболевания за счет многокомпонентности лекарственного средства. Заявляемое лекарственное средство представляет собой высушенный измельченный экстракт из следующих растений: листьев грецкого ореха, листа лещины, листьев репешка, надземной части череды, надземной части дурнишника колючего, листьев крапивы, надземной части ряски, корней цикория, надземной части татарника взятые в соотношении 18, 16, 15, 14, 12, 8, 7, 5, 5%. Сырье измельчают на мельнице для размола сухих проб МРП-2 до размера частиц не более 2 мм и экстрагируют 50-60% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:16 (с учетом коэффициента водопоглощения), при температуре 55-65°С и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом и 2-ом контактах фаз - 60 мин, при 3-ем контакте фаз - 30 мин. Извлечения фильтруют через серошинельное сукно, объединяют, упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 27.0±0.5% от массы растительного сырья. Конечный продукт, представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом, с содержанием влаги - не более 5%. Полученный нами продукт характеризуется как средство, корректирующее нарушения функций щитовидной железы.

Качественное определение БЛВ в экстракте сухом

На основании качественного фитохимического анализа [Государственная, 1987] в полученном сухом экстракте установлено наличие:

1. Дубильных веществ

0.05 г экстракта растворяют в 5 мл воды дистиллированной. К 2 мл полученного раствора прибавляют 2-3 капли раствора железо-аммониевых квасцов, появляется черно-зеленое окрашивание (дубильные вещества).

2. Фенолкарбоновых кислот

Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:

А. н-Бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2)

Б. 15% уксусная кислота

При просмотре хроматограммы в УФ-свете, после обработки парами аммиака, идентифицированы со стандартными образцами:

кофейная кислота - R_f=0.80(A), 0.42(B);

хлорогеновая кислота - R_f-=0.67(A), 0.70(B).

3. Флавоноидов

1.1. 0.1 г экстракта растворяют в 50 мл 50% этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желто-зеленое окрашивание (флавоноиды).

1.2. Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:

А. 15% раствор уксусной кислоты

Б. н-Бутанол - уксусная кислота - вода (40:12:28)

При просмотре хроматограммы в УФ-свете до и после проявления 5% спиртовым раствором алюминия хлорида обнаружены девять веществ флавоноидной природы с Rf₁ 0.03 (А) и 0.87(B); Rf₂ 0.05 и 0.92; Rf₃ 0.04 и 0.73; Rf₄ 0.27 и 0.84; Rf₅ 0.33 и 0.62; Rf₆ 0.40 и 0.38; Rf₇ 0.52 и 0.16; Rf₈ 0.50 и 0.52; Rf₉ 0.59 и 0.54. Доказано наличие рутина, кверцетина, изорамнетина, цинарозида, кемпферола и их гликозидов. Идентификацию проводили со стандартными образцами.

При исследовании спектров поглощения спиртовых извлечений сухого было установлено, что максимумы спектров поглощения спиртовых растворов полиэкстракта близки к таковым ГСО цинарозида. При добавлении к раствору полиэкстракта раствора алюминия хлорида I максимум спектра поглощения смещался к 405 нм и был близок к максимуму спектра поглощения стандартного образца цинарозида, снятого в аналогичных условиях (рис. 1).

Количественное определение БЛВ в сухом экстракте

Около 0.05 г (точная навеска) экстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в 10 мл теплой воды (40-60°С), прибавляют 5.2 мл 96% спирта, доводят объем раствора до метки водой (раствор А). 3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96%о спирте, доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор состоящий из 3 мл раствора А, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность государственного стандартного образца (ГСО) цинарозида. 1 мл приготовленного раствора ГСО цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Раствором сравнения является раствор, состоящий из 1 мл ГСО цинарозида, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид абсолютно сухой экстракт в процентах (X) рассчитывают по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора ГСО цинарозида;

m - масса экстракта в граммах;

m_o - масса ГСО цинарозида в граммах;

W - потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.

Примечание. Приготовление раствора ГСО цинарозида: около 0.05 г (точная навеска) ГСО цинарозида, предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено: 10.72±0.18%.

Предложенный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получать продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты.

Пример

180 г листьев грецкого ореха, 160 г листа лещины, 150 г листьев репешка, 140 г надземной части череды, 120 г надземной части дурнишника колючего, 80 г листьев крапивы, 70 г надземной части ряски, 50 г корней цикория, 50 г надземной части татарника, соответствующие требованиям ГФ XI вып. 2, ст. измельчают на мельнице для размола сухих проб МРП-2 до размера частиц не более 2 мм (сито №20 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 16 л 65% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент равном 1:16 с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Экстрагируют при температуре 60°С и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 65%) спирт в количестве равном объему слитого извлечения (1-ый слив - 11.85 л, 2-ой слив - 11.65 л, 3-ий слив - 10.00 л.). Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 26.6. г готового продукта, что составляет 26.6% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.55%.

Экспериментальные исследования выполнены на 56 крысах-самках с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ №708Н от 23.08.2010 г.«Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом экспериментов животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Протокол исследования согласован с этическим комитетом ИОЭБ СО РАН (протокол №3 от 07.02.2013).

Животные были разделены на шесть групп: интактная группа, контрольная группа и четыре опытные группы, получавшие экстракт сухой комплексного растительного средства и препарат сравнения. Гипотиреоз у животных контрольной и опытных групп моделировали путем внутрижелудочного введения мерказолила (АКРИХИН, Россия) в дозе 10 мг/кг в течение 28 дней [Архипова, 2012]. Далее животным I-III опытных групп внутрижелудочно вводили водный раствор экстракта сухого исследуемого комплексного растительного средства в дозах 100, 200 и 300 мг/кг 1 раз в сутки в течение 20 дней; животным IV опытной группы - водный раствор порошка ламинарии в дозе 6,2 мг/кг (в перерасчете на йод 7,5 мкг/кг) (ЭВАЛАР, Россия). Животные контрольной и интактной групп получали эквиобъемное количество воды, очищенной по аналогичной схеме.

Влияние испытуемых средств на психоэмоциональное состояние животных исследовали в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) согласно Методическим указаниям по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ [Руководство…, 2012]. В тесте ПКЛ регистрировали количество заходов в открытые и закрытые рукава, время пребывания животных в открытых и закрытых рукавах и на центральной площадке. Время тестирования животных составляло 5 минут. В тесте «открытое поле» в течение 3 минут регистрировали: горизонтальную активность (число пересеченных центральных и периферических квадратов), вертикальную активность (число подъемов на задние лапы), норковый рефлекс (число заглядываний в норки), количество актов груминга (чистка) и актов дефекации. Об общей двигательной активности судили по сумме вертикального, горизонтального компонентов и норковому рефлексу.

Для проведения биохимических исследований животных декапитировали под эфирным наркозом. Измеряли массу щитовидной железы. В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определялся уровень тиреотропного гормона (TTG), свободного трийодтиронина (fT3), свободного тироксина (fT4) с помощью набора реактивов Тироид ИФА (Россия) на аппарате STAT-FAX 2100 (AWARENESS TECHNOLOGY INC, USA). На основании данных показателей вычисляли интегральный тиреоидный индекс (ИТИ) и индекс периферической конверсии (ИПК) [Клиническая…, 2015].

ИТИ - это отношение самих гормонов щитовидной железы к их гипофизарному регулятору: ИТИ = (fT3 + fT4) / TTG

Повышение данного индекса - наиболее ранний признак гипертиреоза, тогда как снижение ИТИ отражает даже начальные стадии гипотиреоза.

ИПК - показатель тканевого превращения тироксина в его биологически более активный метаболит трийодтиронин - и рассчитывается по формуле: ИПК = fN4 / fT3

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по приросту продукта пероксидации - малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови [Стальная, Гаришвили, 1977]. Состояние эндогенной антиоксидантной системы характеризовали по активности каталазы в сыворотке крови [Королюк, 1988], супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах [Макаренко, 1988] и по содержанию восстановленного глутатиона (ВГ) в крови [Akerboom, Sies Н., 1981].

Данные полученные в ходе эксперимента были статистически обработаны с определением средней величины и средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m) по общепринятой методике с применением t-критерия Стьюдента при помощи пакета статистических программ Microsoft Exel 2006. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследований показали, что у животных контрольной группы, получавших мерказолил, на фоне снижения в сыворотке крови уровня fT4 и fT3 на 27% и 29% соответственно, активность TTG повысилась в 2,5 раза в сравнении с данными животных интактной группы (Таблица 1). В результате чего, индекс ИТИ в контрольной группе снизился на 67%) и составил 37,6±6,26 против 113,0±7,1 в интакте, что свидетельствует о развитии гипотиреоза. Также у животных данной группы наблюдалась тенденция к нарушению процессов превращения тироксина в более активный метаболит - трийодтиронин, что подтверждает увеличение показателя ИПК (на 12%) по сравнению с интактом.

О развитии у контрольных животных гипотиреоза на фоне курсового введения мерказолила, также свидетельствует достоверное увеличение массы щитовидной железы на 48% по сравнению с данным показателем интактных животных (Таблица 2).

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы животных при р≤0,05; n - количество животных в группе; ИТИ - интегральный тиреоидный индекс; ИПК - индекс периферической конверсии.

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы животных при р≤0,05; n - количество животных в группе.

У животных первой и второй опытных групп, получавших испытуемый экстракт в дозах 100 и 200 мг/кг, несмотря на то, что уровень гормонов щитовидной железы значимо не отличался от показателя контроля (Таблица 1), содержание TTG в сыворотке крови было на 52% и 55% выше показателя контрольных животных. В результате чего ИТИ у животных данных групп составил 85,2±7,92 и 94,4±8,42, что соответственно в 2,7 и 2,5 раза выше показателя контрольных животных.

Наиболее выраженный тиреотропный эффект наблюдался на фоне введения испытуемого экстракта в дозе 300 мг/кг и ламинарии. Так, у животных третьей и четвертой опытных групп уровень fT4 увеличился на 27% и 25%, уровень fT3 - на 35% и 32%) соответственно по сравнению с показателями контрольных животных. На фоне применения исследуемого средства активность TTG в крови животных третьей и четвертой опытных групп была на 55% и 52% ниже показателя контрольных животных, и практически достигала интактного уровня, вследствие чего, ИТИ был выше такового показателя в контроле в 2,7 и 2,6 раза соответственно.

Об ограничении развитии гипотиреоза на фоне испытуемого экстракта также свидетельствовал показатель массы щитовидной железы (Таблица 2). Так, у животных опытных группы масса щитовидной железы соответствовала таковой интактных животных и была на 27-34% ниже показателя контрольных животных.

Результаты тестирования животных в тестах «открытом поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) показали, что длительное введение мерказолила снижает двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность животных и повышает уровень их тревожности (Таблица 3, 4).

Установлено, что у животных контрольной группы при тестировании в «открытом поле» показатель общей двигательной активности был снижен по сравнению с таковым у животных интактной группы на 60% за счет горизонтальной (на 68%) и вертикальной (на 20%) активностей (Таблица 3). Ни одно животное контрольной группы за весь период тестирования не посетило центральные квадраты, и, как следствие, отсутствовал норковый рефлекс. Об эмоциональной нестабильности контрольных животных при экспериментальном гипотиреозе свидетельствовали увеличение актов груминга и дефекаций в 1,6 и 2,4 раза соответственно по сравнению с данными интактных животных (Таблица 3).

Применение экстракта сухого комплексного растительного средства нормализовало поведенческие показатели животных в тесте «открытое поле» (Таблица 3). Наиболее выраженное влияние на двигательную активность животных, сопоставимое с таковым препарата сравнения, испытуемый экстракт проявлял в дозах 200 и 300 мг/кг. Так, количество периферических квадратов, посещенных животными второй-четвертой опытных групп, было в среднем в 3,3 раза выше показателя контрольных животных; вертикальная активность во второй опытной группе - на 11%, а в третьей и четвертой опытных группах - на 26%. Вследствие чего общая двигательная активность у животных указанных групп была в 2,6; 2,8 и 2,4 раза выше таковой у контрольных животных. Влияние испытуемого экстракта в дозах 200 и 300 мг/кг на ориентировочно-исследовательское поведение животных превосходило таковое препарата сравнения - ламинарии. Количество центральных квадратов, посещенных животными второй и третьей опытных групп, было в 3,6 и 5,0 раз выше такового показателя животных, получавших ламинарию, и, как следствие, норковый рефлекс - в 4,0 и 4,6 раза соответственно.

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы животных при р≤0,05; n - количество животных в группе.

В группе животных, получавших испытуемый экстракт в дозе 100 мг/кг, общая двигательная активность была на 47% выше таковой контрольных животных, в основном за счет горизонтальной активности. Так, среднее количество периферических квадратов, которые посетили животные первой опытной группы, было на 68% выше показателя в контроле; 50% животных указанной группы зашли на центральные квадраты установки, тогда как в контрольной группе ни одно животное не посетило центральную область установки.

Повышение у животных опытных групп двигательной и ориентировочно-исследовательской активности можно объяснить снижением у них уровня тревожности (Таблица 3). Количество актов груминга у животных, получавших фитоэкстракт, было на 27-36% ниже такового показателя контрольных животных, количество актов дефекации - на 53-82%. Применение ламинарии снижало данные показатели относительно контроля соответственно на 32% и 24%.

Результаты тестирования животных в ПКЛ показали, что курсовое введение животным мерказолила вызывало снижение количества заходов в открытые рукава лабиринта и время, проведенное в них, соответственно на 54% и 65% по сравнению с таковыми показателями интактных животных (Таблица 4). У контрольных животных также отмечалось снижение (на 60%) количества заходов в закрытые рукава лабиринта, что свидетельствует о снижении у животных двигательной активности.

Применение экстракта комплексного средства нивелировало анксиогенный эффект, развивающийся на фоне экспериментального гипотиреоза. Количество заходов в открытые рукава лабиринта у животных, получавших экстракт сухой в дозах 100-300 мг/кг, увеличивалось в 1,8; 1,9 и 2,2 раза, время пребывания в них - в 1,9; 2,0 и 2,8 раза соответственно по сравнению с таковыми контрольных животных. У животных данных опытных групп количество заходов в закрытые рукава лабиринта было в 2,2; 2,0 и 2,6 раза соответственно выше показателя животных контрольной группы.

На фоне введения животным ламинарии количество заходов в открытые и закрытые рукава ПКЛ, а также время их пребывания в открытых рукавах увеличивались в среднем в 1,5 раза по сравнению с аналогичными данными контрольных животных.

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы животных при р≤0,05; n - количество животных в группе.

В эксперименте установлено, что экспериментальный гипотиреоз вызывает усиление процессов свободнорадикального окисления и снижение антиоксидантной активности ферментов в сыворотке крови (Таблица 5). Так, в контрольной группе животных отмечалось повышение содержания МДА в сыворотке крови в 1,8 раза по сравнению с интактной группой. Одним из факторов усиления процессов ПОЛ являются изменения в антиоксидантной системе (АОС) организма животных контрольной группы, выражающиеся в снижении активности каталазы в сыворотке крови и СОД в эритроцитах на 49% и 65%, а также в уменьшении содержания ВГ в крови на 22% по сравнению с интактом.

Установлено, что курсовое введение животным исследуемого фитосредства уменьшает выраженность окислительного стресса, тем самым снижая интенсивность процесса перекисного окисления липидов и повышая активность антиоксидантной системы организма (Таблица 5). Так, при введении исследуемого средства в дозах 100, 200 и 300 мг/кг отмечалось снижение содержания МДА в сыворотке крови на 35%, 41% и 34% соответственно по сравнению с показателем контрольных животных. Существенное снижение МДА обусловлено тем, что на фоне применения исследуемого фитосредства наблюдается нормализация антиоксидантного статуса организма. Так, у животных первой опытной группы активность каталазы была выше такового показателя контрольных животных в 1,4 раза, у животных второй и третьей опытных групп - в 1,6 раза. Применение испытуемого экстракта в дозах 100 и 300 мг/кг повышало активность СОД в эритроцитах в 1,7 раза по отношению к контролю; более высокая активность данного фермента, двукратно превышающая показатель контрольных животных, наблюдалась у животных третьей опытной группы. Содержание ВГ в крови животных второй и третьей опытных групп было в среднем на 19% выше показателя контрольных животных. У животных, получавших препарат сравнения - ламинарию, активность каталазы, СОД и содержание ВГ были соответственно на 23%, 56% и 23% выше таковых показателей животных контрольной группы.

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с данными контрольной группы животных при p≤0,05; n - количество животных в группе.

Таким образом, исследуемое комплексное фитосредство проявляет выраженную фармакотерапевтическую эффективность при экспериментальном гипотиреозе, нормализуя уровень тиреотропного и тиреоидных гормонов, благодаря чему происходит снижение у животных уровня тревожности, увеличение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности. Выраженная фармакотерапевтическая активность испытуемого фитосредства обусловлена его ингибирующим влиянием на свободнорадикальное окисление биомакромолекул и способностью активировать антиоксидантную систему организма. Технологическая часть.

Для выявления оптимальных технологических режимов нами были изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительного сырья: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и количество экстракций.

Количественная оценка проводилась по выходу экстрактивных веществ [1, 2] и суммы флавоноидов. Метрологические характеристики представлены в таблице 6.

В качестве экстрагентов были использованы вода и этиловый спирт различных концентраций (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96%).

Как видно из таблицы 7, 50-55%) спирт является оптимальным экстрагентом, так как позволяет добиться максимального выхода суммы флавоноидов с учетом выхода экстрактивных веществ.

Выявление оптимальной степени измельчения сырья проводили совместно для всех видов сырья. Количественную оценку проводили по выходу экстрактивных веществ. На основании полученных данных (таблица 8) и с учетом того, что слишком мелкое измельчение растительного материала ведет к загрязнению извлечения труднофильтруемыми высокомолекулярными соединениями, измельчение сырья следует проводить до размера частиц не более 2 мм.

В связи с тем, что в исходном растительном сырье содержатся термолабильные вещества (витамины, иридоиды), изучение влияния температуры на процесс экстракции проводили в интервале температур от 20 до 60°С. Данные представлены в таблице 9, оптимальная температура - 60±5°С.

При изучении влияния соотношения сырье-экстрагент на процесс экстракции установлено (таблица 10), что с увеличением количества экстрагента возрастает выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов, но рост этот для соотношений 1:16 и выше незначителен, поэтому для предотвращения дополнительного расхода экстрагента выбрано соотношение равное 1:(14-16) (с учетом коэффициента водопоглощения).

Для определения продолжительности и необходимого количества экстракций установлено время достижения равновесных концентраций экстрактивных веществ и флавоноидов в системе сырье-экстрагент в ходе трехкратной экстракции. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 40% этиловым спиртом в соотношении 1:14 на водяной бане при температуре 60°С и постоянном перемешивании в колбе с обратным холодильником. Извлечения полученные через определенные промежутки времени (15, 30, 45, 60, 75, 90 мин) в процессе трех экстракций, анализировали на содержание экстрактивных веществ и флавоноидов. Установлено, что равновесные концентрации устанавливаются при 1-ом и 2-ом контактах фаз через 60 мин, при 3-ем контакте фаз через 30 мин (таблица 11). Трехкратная экстракция обеспечивает достаточно полное истощение сырья - извлекается до 96% действующих веществ.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой тиреотропной и антиоксидантной активностью за счет более высокого содержания действующих веществ (флавоноидов).

Посчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и открывают перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Используемая литература

1. Архипова Э.В. Влияние экстракта Potentilla alba L. и комплексного средства "Тиреотон" на течение экспериментального гипотиреоза. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук. - Улан-Удэ, - 2012. - 20 с.

2. Государственная фармакопея СССР: вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. - М., 1987. - 400 с.

3. Захария А.В. Исследование лапчатки белой, как перспективного средства для лечения заболеваний щитовидной железы: Автореф. дисс… канд. биол. наук. - Львов, 1997. 24 с.

4. Клиническая лабораторная диагностика (методы и трактовка лабораторных исследований) / под ред. проф. B.C. Камышникова. - М., 2015. - 720 с.

5. Королюк М.А.., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Методы определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. №6. С. 16-19.

6. Макаренко Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в эритроцитах у больных с хроническими заболеваниями печени // Лабораторное дело. - 1988. - №11. - С. 48-50.

7. Приходько Е.И. Лечение больных тиреотоксикозом травой пестрач белый // Врачебное дело. №6. 1976. С. 66-71.

8. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. В 6 т. Т. 1. Семейства Magnoliaceae - Julandaceae, Ulmaceae, Moraceae, Cannabaceae, Urticaceae. / сост. Беленовская Л.М., Лесиовская E.E., Бобылева Н.С. - СПб., М, 2008. - 421 с.

9. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. В 6 т. Т. 2. Семейства Actinidiaceae-Malvaceae, Euphorbiaceae-Haloragacea / сост. Л.М. Беленовская, Е.Е. Лесиовская, Н.С. Бобылева - СПб., М, 2009. - 513 с.

10. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. В 6 т. Т. 5. 1. Семейства Asteraceae (Compositae). Часть 1. Роды Achillea-Doronicum. / сост. Беленовская Л.М., Лесиовская Е.Е., Бобылева Н.С. - СПб., М, 2012. - 317 с.

11. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. В 6 т. Т. 5. 2. Семейства Asteraceae (Compositae). Часть 1. Роды Achillea-Youngia / сост. Беленовская Л.М., Лесиовская Е.Е., Бобылева Н.С. - СПб., М, 2013. - 312 с.

12. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. В 6 т. Т. 6. Семейства Butomaceae-Typhaceae) / сост. Беленовская Л.М., Лесиовская Е.Е., Бобылева Н.С. - СПб., М, 2014. - 391 с.

13. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятяна. - М.: Гриф и К, 2012. -944 с.

14. Стальная И.Д. Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью ТБК // Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 66-68.

15. The Ecdysone Handbook, 3rd edition, Paris 2007 http://ecdybase.orgAkerboom T.P.M., Sies H. Assay of glutathione, glutathione disulfide and glutathione mixed disulfides in biological samples // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 373-382. Fukuda Т., Ito H., Yoshida T. Antioxidative polyphenols from walnuts (Juglans regia L.) // Phytochemistry. 2003. T. 63. №7. C. 795-801.

17. R., Harmatha J., Marion-Poll F., Dinan L., Wilson I. Compilation of the literature reports for the screening of vascular plants, algae, fungi and non-arthropod invertebrates for the presence of ecdysteroids