07.03.2020
220.018.0a13

Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования. Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности при идентификации патогенных и условно-патогенных бактерий и оценке их количественных соотношений благодаря высокой чувствительности способа и его высокой точности. 1 з.п. ф-лы.
Реферат Свернуть Развернуть

Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности и лабораториях по контролю качества продукции при количественной оценки бактерий, как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию, а также при контроле продукции надзорными ведомствами и лабораториями.

В настоящее время производители продуктов питания сталкиваются с проблемой обсеменения продукции микроорганизмами. Некоторые из них являются патогенными и условно-патогенными. К поражению этими микроорганизмами склонны пожилые люди, младенцы и люди с ослабленным иммунитетом [The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013, EFSA Journal, 2015, vol. 13, no. 1, pp. 1-165]. Наиболее часто встречающимися пищевыми патогенами, вызывающими заболевания являются Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Campylobacter spp., Yersinia spp., Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, а также энтерогеморрагический штамм O157:H7 Escherichia coli [Newell D.G. Koopmans M, Verhoef L, Duizer E, Aidara-Kane A, Sprong H, Opsteegh M, Langelaar M, Threfall J, Scheutz F, van der Giessen J, Kruse H. Food-borne diseases - The challenges of 20years ago still persist while new ones continue to emerge. International Journal of Food Microbiology, 2010, vol. 139, no. 1, pp. 3-15].

На данный момент идентификацию микроорганизмов, в том числе их количественную оценку, в продуктах питания и входящем сырье пищевых предприятий в большинстве случаев проводят классическими методами с использованием посева на питательные среды, их микроскопическом наблюдении и биохимическом анализе [Мао Z., Zheng Н., Wang X., Lin S., Sun Y., Jiang B. DNA microarray for direct identification of bacterial pathogens in human stool samples, Digestion, 2008, vol. 78, no. 2-3, pp.131-138], что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог. Кроме того, такой анализ для ряда патогенных бактерий длится от 5 до 7 дней. Другой альтернативой является проведение реакции ПЦР с праймерами и зондами, специфичным к конкретным патогенным микроорганизмам [Rodriguez-Lazaro D. Real-Time PCR in Food Science: Current Technology and Applications, 2013, Caister Academic Press]. Главным недостатком ПЦР является невозможность количественной оценки идентифицируемых бактерий в субстрате. Кроме того, полимеразная цепная реакция позволяет выявить только какой-либо один микроорганизм, либо небольшую группу микроорганизмов.

Анализ всего микробного сообщества пищевых субстратов возможен с помощью методов секвенирования нового поколения. Для этого чаще всего применяют метод, основанный на анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, который предварительно амплифицируется в ДНК, выделенной из сообществ бактерий [Мауо В., Rachid С.Т., A., Leite A.M., Peixoto R.S., Delgado S. Impact of Next Generation Sequencing Techniques in Food Microbiology, Curr. Genomics., 2014, vol. 15, no. 4, pp. 293-309]. При количественной оценке микроорганизмов методами с использованием высокопроизводительного секвенирования оценивается параметр «relative species abundances», который рассчитывается исходя из количества полученных «ридов» - количество «ридов» прямо пропорционально присутствию микроорганизма в субстрате. Главным недостатком такого подхода является возможность оценивать только относительные количественные соотношения микробов (процентное соотношение различных видов бактерий в исследуемом субстрате). Кром того, по данным высокопроизводительного секвенирования известных количественных соотношений микроорганизмов, полученных в Воронежском государственном университете, количество «ридов» не прямо пропорционально присутствию микроорганизма в субстрате, чаще всего наблюдается картина, при которой подавляющее большинство ридов «оттягивает» ДНК наиболее представительного в смеси вида бактерий. Еще одной проблемой анализа таких данных является полное «доверие» международным биоинформатическим базам данных, которые зачастую содержат ошибочно задепонированные нуклеотидные последовательности. Наличие «контрольных» штаммов значимых для пищевой индустрии микроорганизмов значительно упростит процедуру их идентификации в исследуемых субстратах.

Известен способ профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (патент RU 2605913, опубл. 27.12.2016), взятый за прототип, включающий амплификацию ДНК микробных сообществ с помощью праймеров, специфичных к последовательности 16S рРНК для наиболее значимых таксонов микроорганизмов, а также гибридизацию зондов к амплифицированным нуклеотидным последовательностям. Метод позволяет в том числе оценивать количественные соотношения идентифицируемых бактерий. Недостатком данного способа является то, что спектр анализируемых таксонов бактерий ограничивается набором олигонуклеотидных зондов, что не делает данную систему универсальной для широкого круга таксонов бактерий. Кроме того, для большей достоверности необходимо проведение секвенирования амплифицированных последовательностей, что не предусмотрено в этом способе.

Задачей настоящего изобретения является разработка универсального метода идентификации и количественной оценки бактерий в пищевой продукции с применением высокопроизводительного секвенирования.

Технический результат заключается в разработке универсального высокочувствительного способа идентификации и количественной оценки значимых для пищевой индустрии бактерий в пищевых субстратах и сокращении времени анализа присутствия микроорганизмов в исследуемой среде с 5-7 суток (при стандартном микробиологическом посеве) до 1-2 суток (в зависимости от проведения или не проведения предварительного обогащения бактерий в питательной среде).

Технический результат достигается тем, что в способе идентификация и количественная оценка бактерий в пищевых продуктах осуществляется с помощью проведения ПЦР с универсальными праймерами к 16S рРНК, с последующим высокопроизводительным секвенированием амплифицированных последовательностей и их сопоставлением с международной базой данной и полученными в ходе секвенирования контрольными нуклеотидными последовательностями. В анализе используются известные количественные смеси бактерий, которые наиболее значимы для пищевой индустрии, секвенированные последовательности которых выступают в качестве контрольных последовательностей, что позволяет резко повысить точность используемого метода, как в идентификации таксонов бактерий, так и оценки их количественных соотношений.

Способ идентификации патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах в представленном способе реализуется следующим образом:

1. Производится асептический сбор биологического материала (молоко, мясо, входящее сырье предприятия и др.). Для анализа используется 1-25 мл (г) биологического материала.

2. При необходимости проводится предварительное обогащение микроорганизмов в универсальной жидкой питательной среде (например, пептонная вода в соотношении 1:10 в течение 24 часов).

3. Проводится отбор необходимого для выделения ДНК количества биологического материала, либо обогащенной среды полученной в ходе выполнения пункта 2.

4. Производится выделение ДНК из отобранного биологического материала, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.

5. Проводят ПЦР с универсальными к бактериям праймерами: 785F (GGATTAGATACCCTGGTA)/ 1100R (GGGTTGCGCTCGTTG). Могут быть использованы другие универсальные для бактерий праймеры (например, 515F/ 806R, 341F/ 806R, 515F/ 907R и др.). Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 37 циклов (94°С 30 сек, 50-54°С 30 сек, 72°С 30-40 сек).

6. Отличительной особенностью данного способа является то, что параллельно с анализом исследуемых проб проводится ПНР с праймерами из пункта 5, но при этом используются известные количественные смеси бактерий, которые наиболее значимы для пищевой индустрии: Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazii, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus.

7. Продукты реакции ПЦР далее используются для приготовления библиотек ДНК для высокопроизводительного секвенирования, включающее очистку ампликона от коротких неспецифических нуклеотидных последовательностей и праймеров, лигирование адаптеров к концам амплифицированных последовательностей и оценку качества приготовленных библиотек. При этом для анализа известных количественных смесей микроорганизмов используются отдельные адаптеры с «баркодами» которые позволяют отфильтровать эти данные при биоинформатическом анализе.

8. Проводится другие этапы необходимые для конкретного способа секвенирования нового поколения и выбранной платформы секвенирования (например, эмульсионная ПЦР при использовании платформы для полупроводникового секвенировакния Ion torrent).

9. Осуществляется секвенирование приготовленных в процессе выполнения п. 1-п. 8. нуклеотидных последовательностей.

10. Проводиться биоинформатический анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей с использованием пользовательской базы данных и программного обеспечения, либо с использованием международных баз данных. При этом учитываются данные секвенирования известных смесей бактерий, верифицированные «риды» которых используются как контрольные нуклеотидные последовательности. Относительное изобилие (relative abundance) бактерий также рассчитывается исходя из полученных данных секвенирования известных микробиологических смесей.

11. При совпадении (идентичность свыше 99,5%) секвенированных нуклеотидных последовательностей с последовательностями, полученными в ходе секвенирования известных смесей бактерий говорят наличие того или иного патогенного либо условно-патогенного микроорганизма. По соотношению полученных «ридов» контрольных смесей бактерий и «ридов» полученных в ходе секвенирования анализируемых образцов пищевой продукции судят о количестве идентифицированных бактерий в субстрате.

Примечание: для высокопроизводительного секвенирования используются платформы и наборы химических реактивов, способные секвенировать последовательности длинной до 400 п.н.

Предлагаемый способ является высокочувствительным, универсальным и быстрым по отношению к другим методам определения патогенных микроорганизмов в пищевых субстратах. Кроме того, представленный метод позволяет оценить количественное соотношение микроорганизмов в анализируемом субстрате.

Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 79.
25.08.2017
№217.015.c3fe

Способ одновременной оценки потенциала доннана в восьми электромембранных системах

Изобретение относится к области потенциометрических методов анализа и мембранных технологий и может быть использовано для совместного определения органических и неорганических ионов в многокомпонентных водных средах. Способ одновременной оценки потенциала Доннана в восьми электромембранных...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617347
Дата охранного документа: 24.04.2017
29.12.2017
№217.015.f3f3

Устройство для кардиореспираторного анализа и способ оценки кардиореспираторного состояния

Изобретения относятся к медицине. Устройство для кардиореспираторного анализа содержит корпус с закрепленными на нем блоком управления и инфракрасным пульсоксиметрическим датчиком для измерения частоты пульса и оксигенации крови. Корпус выполнен в виде снабженной рукоятью телескопической...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002637917
Дата охранного документа: 07.12.2017
19.01.2018
№218.016.098f

Устройство формирования фазоманипулированного сигнала с плавным изменением фазы между элементарными импульсами

Изобретение относится к области радиотехники и может быть использовано в системах радиосвязи и радиолокации. Устройство формирования фазоманипулированного семиэлементным кодом Баркера сигнала содержит генератор синхроимпульсов, многоотводную линию задержки, сумматор, а также линию задержки на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002631899
Дата охранного документа: 29.09.2017
17.02.2018
№218.016.2c48

Способ количественного определения таурина и аллантоина при совместном присутствии методом вэжх

Изобретение относится к способу количественного определения методом ВЭЖХ таурина и аллантоина при их совместном присутствии в различных лекарственных препаратах, биологически активных добавках, косметической и пищевой продукции. Способ включает растворение навески исследуемого вещества в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002643312
Дата охранного документа: 31.01.2018
17.02.2018
№218.016.2c63

Способ удаления фоторезистивных пленок с поверхности оптических стекол

Изобретение относится к технологии изготовления изделий оптической техники, конкретно к способу удаления фоторезистивных пленок с поверхности оптических стекол, служащих в качестве основной маски при формировании микроэлементов на их поверхности. Технический результат изобретения заключается в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002643172
Дата охранного документа: 31.01.2018
17.02.2018
№218.016.2d4a

Генератор сверхкоротких импульсов с электронным управлением длительностью

Изобретение относится к импульсной СВЧ технике, а именно к устройствам формирования импульсных сигналов сверхмалой длительности с функцией управления длительностью. Техническим результатом является реализация управления длительности формируемого сверхкороткого импульса за счет использования...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002643616
Дата охранного документа: 02.02.2018
10.05.2018
№218.016.4938

Способ получения пленок сульфида кадмия на монокристаллическом кремнии

Изобретение относится к получению поликристаллических пленок сульфида и оксида кадмия на монокристаллическом кремнии с помощью техники пиролиза аэрозоля раствора на нагретой подложке при постоянной температуре в интервале 450-500°С. Согласно изобретению пиролиз аэрозоля проводят в два этапа: на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002651212
Дата охранного документа: 18.04.2018
10.05.2018
№218.016.4cb9

Способ получения нанопорошков пористого кремния

Изобретение относится к области получения наноматериалов, а именно нанопорошков кремния, и может быть использовано в стоматологии и биомедицине для получения фотолюминесцентных меток. Нанопорошки пористого кремния получают путем травления исходного монокристаллического кремния в ячейке...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002652259
Дата охранного документа: 25.04.2018
10.05.2018
№218.016.4ce7

Способ получения эфиров полиглицерина из отходов производства растительных масел

Изобретение относится к области органической химии и химии поверхностно-активных веществ, а именно к способу получения сложных эфиров полиглицерина и жирных кислот из отходов производства растительных масел, которые проявляют свойства эмульгаторов и могут найти применение в средствах бытовой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002652378
Дата охранного документа: 26.04.2018
10.05.2018
№218.016.4d4a

Способ стимуляции роста микроклонов вейгелы цветущей "вариегата" низкими концентрациями хлорида натрия

Изобретение относится к растениеводству, лесному, лесопарковому и сельскому хозяйству, а именно к питомниководству. Способ стимулирования роста микроклонов включает культивирование микроклонов вейгелы цветущей «вариегата» на питательной среде 1/2 WPM (Woody Plant Medium), содержащей половинное...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002652391
Дата охранного документа: 26.04.2018
Показаны записи 1-10 из 16.
20.03.2013
№216.012.3026

Способ ранней диагностики послеродового эндометрита

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ ранней диагностики послеродового эндометрита, включающий выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала у женщин на поздних сроках беременности или на 3-4 сутки после родов, проведение обратной транскрипции с получением кДНК...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002477861
Дата охранного документа: 20.03.2013
25.08.2017
№217.015.a4b1

Биосовместимый наноматериал для фотосенсибилизации синглетного кислорода и способ его получения

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к онкологии, и описывает биосовместимый наноматериал и способ его получения. Предлагаемый биосовместимый наноматериал представляет собой гибридные ассоциаты коллоидных квантовых точек CdS средними размерами 2-4 нм с катионами...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002607579
Дата охранного документа: 10.01.2017
25.08.2017
№217.015.b5bd

Способ определения концентрации пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа определения концентрации пероксида водорода в выдыхаемом воздухе у животных. Способ включает конденсирование и охлаждение выдыхаемого воздуха с помощью устройства для сбора конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) с последующей оценкой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614621
Дата охранного документа: 28.03.2017
25.08.2017
№217.015.c1c8

Способ идентификации клопа вредной черепашки (eurygaster integriceps puton, 1881) на основе рестрикционного анализа гена цитохромоксидазы митохондриальной днк

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к молекулярно-генетическому способу идентификации клопа вредной черепашки (Eurygaster integriceps). Производят сбор биологического материала и выделяют ДНК. Проводят ПЦР участка цитохромоксидазы митохондриальной ДНК. В качестве праймеров...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617935
Дата охранного документа: 28.04.2017
19.01.2018
№218.016.0873

Способ дифференциации коммерчески значимых клещей рода amblyseius на основе рестрикционного анализа

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ дифференциации коммерчески значимых клещей рода Amblyseius на основе рестрикционного анализа. Данный способ включает выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение ПЦР участка цитохромоксидазы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002631933
Дата охранного документа: 28.09.2017
18.05.2018
№218.016.5147

Способ дифференциации ключевых пород медоносных пчел в россии на основе мутагенной пцр-пдрф

Изобретение относится к биохимии. Описан способ дифференциации пород медоносных пчел России на основе мутагенной ПЦР-ПДРФ. Изобретение может быть использовано для идентификации пород пчел в пчеловодческих предприятиях и пасеках. Технический результат заключается в проведении дифференциации...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002653435
Дата охранного документа: 08.05.2018
05.07.2018
№218.016.6bf3

Мультикомпонентный субстрат для хранения и транспортировки агентов биологической защиты растений, а также других мелких животных

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Субстрат содержит измельченную древесину и вермикулит вспученный. Для пропитки вермикулита используют жидкость на водной основе, содержащую антибактериальные и антигрибковые компоненты и поверхностно активные вещества. Изобретение позволяет улучшить...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002659830
Дата охранного документа: 04.07.2018
10.08.2018
№218.016.7b0b

Способ определения генотоксичности ксенобиотиков на основе анализа повреждений митохондриальной днк земляного шмеля (bombus terrestris)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ определения генотоксичности ксенобиотиков на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК земляного шмеля (Bombus terrestris). Способ включает проведение кормления земляных шмелей () тестируемым ксенобиотиком на протяжении суток, забор...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002663719
Дата охранного документа: 08.08.2018
25.10.2018
№218.016.95c7

Способ оценки токсичности и питательной ценности кормов для пчел и шмелей, продуктов пчеловодства и других пищевых продуктов на искусственных микроколониях шмелей

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к оценке питательной ценности и наличия опасных примесей в кормах для пчел и шмелей и продуктов пчеловодства. Для этого проводят количественную оценку состояния искусственных микроколоний земляных шмелей, получающих корма с тестируемыми...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002670448
Дата охранного документа: 23.10.2018
27.12.2018
№218.016.ac05

Способ идентификации дрожжей рода pichia на основе пцр в реальном времени с использованием taqman зонда

Изобретение относится к области микробиологии и предназначено для идентификации дрожжей рода Pichia. Осуществляют предварительное обогащение дрожжей, осаждение их центрифугированием, выделение ДНК с проведением ПЦР в реальном времени. Для амплификации используются праймеры и Taqman зонд....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002676099
Дата охранного документа: 26.12.2018

Похожие РИД в системе