Способ идентификации клопа вредной черепашки (Eurygaster integriceps Puton, 1881) на основе рестрикционного анализа гена цитохромоксидазы митохондриальной ДНК

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к молекулярно-генетическим методам идентификации организмов – клопа вредной черепашки (Eurygaster integriceps), и может быть использовано при определении наличия этого вредителя на посевах пшеницы и ячменя.

В составе рода Eurygaster Laporte насчитывается 10 видов, непосредственно в России - 6 ( U. Family Scutelleridae Leach, 1815. In: Aukema В, Rieger С, editors. Catalogue of the Heteroptera of the Palaearctic Region, 5. Pentatomomorpha II. Netherlands Entomological Society; 2006; 233-414). Известно, что в европейской части России распространены 5 видов этого рода. Четыре из них являются вредителями зерновых культур: Еu. integriceps Puton, 1881, Еu. maura (Linnaeus, 1758), Еu. testudinaria (Geoffroy, 1785) и Еu. austriaca (Schrank, 1776). Пятый вид этого рода, встречающийся в фауне России, Еu. dilaticollis (Dohrn, 1860), живет в природных степных экосистемах и на пастбищах, питается соками дикорастущих злаков. Вред, наносимый сельскохозяйственным культурам Еu. dilaticollis, не установлен. Самым опасным представителем Eurygaster является Еu. integriceps. Данный вид широко распространен в Восточной Европе, Средней Азии и Ближнем Востоке, включая такие страны как Турция, Иран, Ирак, Сирия, Израиль, Хорватия, Сербия, Италия, Украина, Греция, Болгария, Румыния, Таджикистан, Узбекистан, Киргизия, Пакистан, Российская Федерация и др. (Critchley B.R. Literature review of sunn pest Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera: Scutelleridae). Crop Protection. 1998; 17(4): 271-287). Он способен размножаться в высокой численности на посевах зерновых культур (пшенице, ячмене), снижая их урожайность. Установлено, что при поражении посевов зерновых этим видом клопов общие потери урожая могут достигать 20-30% для ячменя и 50-90% для пшеницы (Gul Α., Cuma Α., Mithat D. Sunn pest control policies and effect of Sunn pest damage on wheat quality and price in Turkey. Quality and Quanity. 2006; 40: 469-480). Кроме прямых потерь урожая пшеницы также сильно ухудшаются хлебопекарные качества муки, полученной из поврежденных зерен вследствие деградации протеолитическими ферментами клопа глютена зерен (Darkoh С., El-Bouhssini M., Baum M., Clack В. Characterization of a prolyl endoprotease from Eurygaster integriceps Puton (Sunn pest) infested wheat. Arch Insect Biochem. Physiol. 2010; 74(3): 163-78).

Из источников информации (Голуб В.Б., Великань B.C., Гурьева Е.Л. и др. Отряд Полужесткокрылые, или Клопы - Hemiptera (=Heteroptera). Определитель вредных и полезных насекомых и клещей зерновых культур в СССР. Сост. Л.М. Копанева. Л.: Колос. Ленингр. Отд-ние, 1980; 80-91) известно, что дифференцирование вредной черепашки от других представителей клопов-черепашек на данный момент возможно только по морфологическим признакам, что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный специалист-энтомолог. Кроме того, данный способ не всегда можно применять при обнаружении вредителя на посевах, т.к. ключевые признаки, позволяющие дифференцировать вредную черепашку от других видов, имеются только у взрослых особей.

Известен способ определения сроков появления личинок вредной черепашки (патент РФ №2010515, МПК А01К 67/033), включающий учет температурных характеристик окружающей среды, отличающийся тем, что в полевых условиях определяют сроки появления первых яйцекладок вредной черепашки на полях озимой пшеницы и длительность развития стадии яйца вредителя, а сроки появления личинок определяют как сумму срока появления первых яйцекладок и длительности развития стадии яйца вредителя, при этом длительность развития стадии яйца определяют по формуле N=(0,2569+0,0358T_cp-0,0009T_cp²), где Ν - длительность развития стадии яйца, сут; Т_ср - средняя температура воздуха по данным метеослужбы за две декады вперед.

Недостатком данного способа является то, что не учитывается видовой состав популяции. Невозможно дифференцировать вредную черепашку от других видов того же рода по яйцам только по морфологическим признакам. Идентификация вредителя на основе ДНК позволит дифференцировать яйца вредной черепашки от яиц маврской черепашки, влаголюбивой черепашки и других морфологически сходных видов клопов.

В качестве прототипа рассмотрен способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1 (патент RU 2528743, МПК C12N 15/06, C12Q 1/68), включающий проведение ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1. Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (=310 нм). На этапе ПЦР используются последовательности олигонуклеотидных праймеров: DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO: 1), DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO: 2), DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO: 3), а на этапе рестрикции применяется рестриктаза - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp, и генотип АК=100/82/18 bp.

Задачей настоящего изобретения является разработка молекулярно-генетического метода идентификации вредной черепашки, не требующего присутствия узко квалифицированного специалиста, для повышения эффективности мер по обработке посевов от вредителя.

Существенным преимуществом заявляемого молекулярно-генетического метода идентификации вредителя является возможность его определения еще на стадиях яйца, личинки и куколки в независимости от пола, что в свою очередь позволит применять превентивные меры защиты растений.

Нами предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности гена цитохромоксидазы субъединицы 1 у видов рода Eurygaster в России. Последовательности внесены в международную систему Genbank (acession numbers: KR105371.1, KR105370.1, KR105369.1, KU726545, KU760760, KU760761, KU760762, KU760763, KU760764). Установлены отличия в нуклеотидной последовательности между вредной черепашкой (Eurygaster integriceps) и остальными видами клопов-черепашек, которые позволяют разработать метод экспресс-идентификации данного вида клопа на основе рестрикционного анализа гена цитохромоксидазы.

Технический результат - проведение идентификации вредителя на его ранних стадиях развития (яйца, личинки) и взрослых вне зависимости от пола насекомого, а также возможность проведения идентификационных процедур в течение нескольких часов без привлечения энтомолога.

Технический результат достигается тем, что в способе идентификации вредной черепашки (Eurygaster integriceps) на основе рестрикционного анализа предварительно амплифицированного гена цитохромоксидазы митохондриальной ДНК, включающем выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение ПНР участка цитохромоксидазы митохондриальной ДНК, рестрикционного анализа ампликона, проведение электрофореза в агарозном геле, согласно изобретению, при проведении ПЦР используют праймеры прямой EuCO1F: GAATATGAGCCGGAATAGTAGGA (SEQ ID NO: 3) и обратный EuCO1R: ATGTGTTGAAGTTACGGTCA (SEQ ID NO: 4), а для рестрикционного анализа используют рестриктазы Аhl I, BamH I, Bst2U I, Psi I, причем наличие одного из наборов фрагментов: 317, 268 п.н. для рестриктазы Аhl I, 471, 114 п. н. для BamH I, 364, 221 п. н. для Bst2U I и 435, 150 п.н. для Psi I указывает на принадлежность вредителя к роду Eurygaster integriceps

Способ идентификации вредной черепашки (Eurygaster integriceps) на основе рестрикционного анализа предварительно амплифицированного гена цитохромоксидазы субъединицы 1 реализуется следующим образом:

1. Производится сбор биологического материала (взрослые насекомые, яйца, личинки) с посевов пшеницы или ячменя. Если анализ производится не в тот же день, то образцы для хранения помещают в 70% спиртовой раствор.

2. Производится выделение ДНК из полученных образцов, выделение ДНК можно проводить как с помощью коммерческих наборов отечественных и зарубежных производителей ("ДНК-технологии", "Праймтех", "Zymo research", БиоСилика и др.), так и общепринятыми методами (фенол-хлороформная экстракция, ЦТАБ-метод).

3. Проводят ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35 циклов: 94°С 30 сек, 58°С 30 сек, 72°С 40 сек, конечная элонгация 72°С 8 мин. В качестве праймеров используют следующие: прямой EuCO1F: GAATATGAGCCGGAATAGTAGGA (SEQ ID NO: 3), обратный EuCO1R: ATGTGTTGAAGTTACGGTCA (SEQ ID NO: 4), данные праймеры высокоспецифичны к роду Eurygaster и амплифицируют продукт гена цитохромоксидазы длиной 569 п.н.

4. Продукты ПЦР подвергают рестрикции по следующей схеме: берут 10 мкл ПЦР продукта, добавляют 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, индивидуального для каждой рестриктазы, и 10 ед. рестриктазы. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Инкубируют смесь в течение 1,5 часов при 37°С, фермент инактивируют нагревом до 75°С в течение 15 минут. Визуализацию продуктов рестрикции проводят с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве рестриктаз используют следующие: Аhl I, BamH I, Bst2U I, Psi I. Каждый из рестрикционных ферментов образует уникальные фрагменты у вредной черепашки (таблица 1). При этом для идентификации вредителя Е. integriceps можно использовать любую из представленных рестриктаз, либо несколько рестриктаз.

На фиг. 1 приведена Таблица 1 длины ожидаемых фрагментов при расщеплении последовательности цитохромоксидазы длиной 569 п. н.

На фиг. 2 изображена электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР цитохромоксидазы, субъединица 1.

Пример

На электрофореграмме (фиг. 2) 1 - рестриктаза BamH I, образец ДНК №1; 2 - рестриктаза BamH I, образец ДНК №2; 3 - Рестриктаза Ahl I, образец ДНК №1; 4 - Рестриктаза Ahl I, образец ДНК №2; M - маркер длин фрагментов ДНК, значения выражены в пар нуклеотидов.

При обработке рестриктазой BamH I продукта ПЦР образца ДНК №1 фрагменты не образовались, следовательно, это ДНК Еu. maura или Еu. testudinaria или Eu. dilaticollis. При обработке рестриктазой BamH I продукта ПЦР образца ДНК №2 образовались два фрагмента длиной 471 и 114 п.н., следовательно, это ДНК Eu. integriceps.

При обработке рестриктазой Аhl I продукта ПЦР образца ДНК №1 образовались 3 фрагмента длиной 316, 175, 93, следовательно, это ДНК Еu. maura или Eu. testudinaria или Eu. dilaticollis. При обработке рестриктазой Аhl I продукта ПЦР образца ДНК №2 образовались два фрагмента длиной 317 и 268 п. н., следовательно, это ДНК Eu. integriceps.

Предлагаемый способ идентификации вредной черепашки является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и недорогим. В зависимости от используемого способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.