Способ идентификации патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования

Настоящее изобретение относится к микробиологии и касается способов измерения, использующих микроорганизмы, а именно, нуклеиновые кислоты. Данное изобретение может быть использовано в пищевой промышленности и лабораториях по контролю качества продукции при идентификации патогенных микроорганизмов, как во входящем сырье пищевого предприятия, так и на разных этапах производства, включая конечную продукцию, а также при контроле продукции надзорными ведомствами и лабораториями.

В настоящее время производители продуктов питания сталкиваются с проблемой обсеменения продукции патогенными микроорганизмами. Патогенные микроорганизмы способны вызывать заболевания человека. К проявлению самых тяжелых последствий поражения этими микроорганизмами склонны младенцы, пожилые люди и люди с ослабленной иммунной системой [The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013, EFSA Journal, 2015, vol. 13, no. 1, pp.1-165]. Список болезней пищевого происхождения постоянно обновляется, до 1960-х годов наиболее часто встречающимися пищевыми патогенами, вызывающими заболевания, были Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Clostridium botulinum и Staphylococcus aureus. В 1980-х и 1990-х годах к этому списку были добавлены новые патогенные виды, такие как Campylobacter spp., Yersinia spp., Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Enterococcus faecalis, a также энтерогеморрагический штамм O157:H7 Escherichia coli [Newell D.G. Koopmans M, Verhoef L, Duizer E, Aidara-Kane A, Sprong H, Opsteegh M, Langelaar M, Threfall J, Scheutz F, van der Giessen J, Kruse H. Food-borne diseases - The challenges of 20years ago still persist while new ones continue to emerge. International Journal of Food Microbiology, 2010, vol. 139, no. 1, pp. 3-15].

На данный момент идентификацию патогенных микроорганизмов в продуктах питания и входящем сырье пищевых предприятий в большинстве случаев проводят классическими методами с использованием посева на питательные среды, их микроскопическом наблюдении и биохимическом анализе [Мао Z., Zheng Н., Wang X., Lin S., Sun Y., Jiang B. DNA microarray for direct identification of bacterial pathogens in human stool samples, Digestion, 2008, vol. 78, no. 2-3, pp.131-138], что является сложной задачей, которую способен решить только высококвалифицированный микробиолог. Кроме того, такой анализ для ряда патогенных бактерий длится от 5 до 7 дней. Другой альтернативой является проведение реакции ПЦР с праймерами и зондами специфичным к конкретным патогенным микроорганизмам [Rodriguez-Lazaro D. Real-Time PCR in Food Science: Current Technology and Applications, 2013, Caister Academic Press]. Недостатком данного подхода является возможность проведения анализа только на какой-либо один патогенный микроорганизм, отсутствует возможность идентифицировать сразу все значимые патогенные микроорганизмы.

Анализ всего микробного сообщества пищевых субстратов возможен с помощью методов секвенирования нового поколения. Для этого чаще всего применяют метод основанный на анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, который предварительно амплифицируется в ДНК, выделенной из сообществ бактерий [Мауо В., Rachid С.Т., A., Leite A.M., Peixoto R.S., Delgado S. Impact of Next Generation Sequencing Techniques in Food Microbiology, Curr. Genomics., 2014, vol. 15, no. 4, pp. 293-309]. Недостатком данного подхода является то, что праймеры, использующиеся для амплификации 16S рРНК являются универсальными для всех таксонов бактерий и в случае избыточного количества того или иного таксона бактерий в анализируемой среде (например, лактобактерий и бифидобактерий) можно не обнаружить бактерий, которые находятся в минорных количествах, что, зачастую, характерно для патогенных микроорганизмов.

Известен способ профилирования микробиоты желудочно-кишечного тракта (патент RU 2605913, МПК C12Q 1/68, C12N 15/11, опубл. 27.01.2015), взятый за прототип, включающий амплификацию ДНК микробных сообществ с помощью праймеров, специфичных к последовательности 16S рРНК, для наиболее значимых таксонов микроорганизмов, а также гибридизацию зондов к амплифицированным нуклеотидным последовательностям. Недостатком данного способа является низкая специфичность последовательности гена 16S рРНК для конкретных таксонов патогенных бактерий, что не позволяет разработать универсальную систему для детекции всех значимых для пищевой промышленности микроорганизмов. Кроме того, для большей достоверности необходимо проведение секвенирования амплифицированных последовательностей, что не предусмотрено в этом способе.

Задачей настоящего изобретения является разработка универсального метода обнаружения значимых для пищевой промышленности патогенных микроорганизмов с применением высокопроизводительного секвенирования.

Технический результат заключается в разработке универсального высокочувствительного способа обнаружения перечня значимых патогенных бактерий в пищевых субстратах в течение 1-2 суток.

Технический результат достигается тем, что в способе идентификации патогенных бактерий в пищевых продуктах осуществляется с помощью проведения мультиплексной ПЦР с праймерами, специфичными к конкретным таксонам патогенных микроорганизмов, с последующим высокопроизводительным секвенированием амплифицированных последовательностей. Совпадение секвенированных нуклеотидных последовательностей с контрольными нуклеотидными последовательностями свидетельствует о присутствии того или иного патогенного микроорганизма в анализируемом субстрате.

Предварительно проведен анализ нуклеотидной последовательности участков ДНК в международной системе GenBank для следующих значимых для пищевой промышленности патогенных бактерий: Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Clostridium tyrobutyricum, Cronobacter sakazii, Escherichia coli (EHEC), Escherichia coli (STEC/VTEC), Listeria monocytogenes, Mycobacterium tubercolosis, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus. Установлены специфические нуклеотидные последовательности для данных таксонов, которые позволяют разработать метод экспресс идентификации этих бактерий с помощью проведения мультиплексной ПЦР с последующим высокопроизводительным секвенированием амплифицированных последовательностей. Разработана панель праймеров, которая позволяет одновременно амлифицировать специфичные ко всем значимым для пищевой промышленности патогенным бактериям участки ДНК без формирования каких-либо вторичных структур между праймерами. Совпадение полученных в ходе ПЦР с помощью данной панели праймеров нуклеотидных последовательностей с контрольными нуклеотидными последовательностями свидетельствует о наличии того или иного патогенного микроорганизма в анализируемой среде с идентификацией видовой или родовой принадлежности найденного патогена.

Способ идентификации патогенных бактерий в пищевых субстратах в представленном способе реализуется следующим образом:

1. Производится асептический сбор биологического материала (молоко, мясо, входящее сырье предприятия и др.). Для анализа используется 1-25 мл биологического материала.

2. В качестве опции (в особенности к твердым пищевым продуктам, таким как мясные изделия) проводится предварительное 24-часовое обогащение образца в среде для специфического культивирования микроорганизмов (например, селенитовый бульон для сальмонелл), либо универсальной среде (например, пептонная вода). Объемное соотношение пищевой субстрат: среда обогащения составляет 1:10.

3. Проводится отбор необходимого для выделения ДНК количества биологического материала, либо обогащенной среды, полученной в ходе выполнения пункта 2.

4. Производится выделение ДНК из отобранного биологического материала, выделение ДНК можно осуществлять как с помощью коммерческих наборов, так и методами органической экстракции.

5. Проводят мультиплексную ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 94°С 4 мин, 35 циклов (94°С 30 сек, 55°С 30 сек, 72°С 30 сек.)

Используются одновременно все следующие праймеры, согласно перечню последовательностей: прямой SEQ ID NO 1 и обратный SEQ ID NO 18 для определения патогенных бактерий Bacillus cereus, прямой SEQ ID NO 2 и обратный SEQ ID NO 19 для Campylobacter coli, прямой SEQ ID NO 3 и обратный SEQ ID NO 20 для Campylobacter jejuni, прямой SEQ ID NO 4 и обратный SEQ ID NO 21 для Clostridium perfringens, прямой SEQ ID NO 5 и обратный SEQ ID NO 22 для Clostridium tyrobutyricum, прямой SEQ ID NO 6 и обратный SEQ ID NO 23 для Cronobacter sakazii, прямой SEQ ID NO 7 и обратный SEQ ID NO 24 для Escherichia coli (EHEC), прямой SEQ ID NO 8 и обратный SEQ ID NO 25 для Escherichia coli (STEC/VTEC), прямой SEQ ID NO 9 и обратный SEQ ID NO 26 для Listeria monocytogenes, прямой SEQ ID NO 10 и обратный SEQ ID NO 27 для Mycobacterium tubercolosis, прямой SEQ ID NO 11 и обратный SEQ ID NO 28 для Proteus mirabilis, прямой SEQ ID NO 12 и обратный SEQ ID NO 29 для Salmonella enterica, прямой SEQ ID NO 13 и обратный SEQ ID NO 30 для Shigella flexneri, прямой SEQ ID NO 14 и обратный SEQ ID NO 31 для Shigella boydii, прямой SEQ ID NO 15 и обратный SEQ ID NO 32 для Shigella sonnei, прямой SEQ ID NO 16 и обратный SEQ ID NO 33 для Staphylococcus aureus, прямой SEQ ID NO 17 и обратный SEQ ID NO 34 для Vibrio cholera.

Данные праймеры амплифицируют специфические для каждого вышеперечисленного таксона продукт ПЦР, при этом для амплификации не используется регион 16S рРНК.

6. Продукты реакции ПЦР далее используются для приготовления библиотек ДНК для высокопроизводительного секвенирования, включающего очистку ампликона от коротких неспецифических нуклеотидных последовательностей и праймеров, легирование адаптеров к концам амплифицированных последовательностей и оценку качества приготовленных библиотек.

7. Проводится другие этапы, необходимые для конкретного способа секвенирования нового поколения и выбранной платформы секвенирования (например, эмульсионная ПЦР при использовании платформы для полупроводникового секвенировакния Ion torrent).

8. Осуществляется секвенирование приготовленных в процессе выполнения п. 1 - п. 7. нуклеотидных последовательностей.

9. Проводиться биоинформатический анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей с использованием пользовательской базы данных и программного обеспечения, либо с использованием международных баз данных.

10. При совпадении (идентичность свыше 95%) секвенированных нуклеотидных последовательностей с последовательностями из базы данных делается вывод о присутствии того или иного патогена в исследуемом пищевом субстрате.

Для высокопроизводительного секвенирования используются платформы и наборы химических реактивов, способные секвенировать последовательности длинной до 400 п.н.

Предлагаемый способ является высокочувствительным, универсальным и быстрым по отношению к другим методам определения патогенных микроорганизмов в пищевых субстратах.

Перечень последовательностей

Праймеры