Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики активности сочетанной инфекции у детей с острыми респираторными инфекциями

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинико-лабораторной диагностики острых респираторных инфекций (ОРИ) у детей, и может быть использовано для выявления активности инфекционного процесса при идиопатической лейкопении и фебрильных судорогах.

Острые респираторные инфекции лидируют в структуре инфекционных заболеваний, как по распространенности, так и по экономическому ущербу в России. Исследования последних лет показали, что у детей с ОРИ достаточно часто выявляются активные формы герпесвирусных инфекций, в то время как у клинически здоровых инфекция имеет латентное течение. Среди ОРИ могут встречаться как случаи острой первичной инфекции, вызванной вирусом герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6), так и реактивации хронической персистирующей инфекции. По данным ряда авторов именно ВГЧ-6 обуславливает в 50% случаев фебрильные судороги у детей при ОРИ, а также вызывает такой опасный синдром, как идиопатическая лейкопения, ведущий к стойкому снижению иммунитета. Однако влияние ВГЧ-6 на этиологию и тяжесть течения ОРИ не оценено, более того остается малоизученной проблема генетической изменчивости ВГЧ-6, для учета вклада генотипа в течение и тяжесть ОРИ при сочетании этиологически значимых агентов. Поэтому своевременное выявление активности вирусного процесса, связанного с ВГЧ-6, с последующим определением генотипов А и В для диагностики и прогноза течения заболеваниями у детей различного возраста обуславливает актуальность изучения данной проблемы.

В статье (Кожевникова Е.Н., Шипулин Г.А., Горелов А.В. Современные возможности диагностики респираторных вирусных инфекций // Инфекционные болезни. - 2005. - №1 (3). - С. 51-54) показана значимость полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики и выявления этиологии ОРИ. К преимуществам метода следует отнести возможность выявления нескольких возбудителей одновременно в одной реакции в формате multiplex и возможность детекции специфических продуктов реакции в режиме реального времени, однако авторы не конкретизируют спектр вирусов, который предлагается выявлять для скрининга ОРИ; для серодиагностики предлагается дополнительно использовать иммуно-ферментный анализ (ИФА), без углубленного исследования характера иммунного ответа, что не дает сведений об активности вирусного процесса, тяжести заболевания и прогнозе его дальнейшего течения.

В настоящее время известны способы идентификации генотипов вируса ВГЧ-6 (А и В) (RU 2627607 C1, CN 103820574 (А) - 2014-05-28). Способы позволяют определять специфические для ВГЧ-6А и ВГЧ-6 В однонуклеотидные полиморфизмы методом ПЦР в формате реального времени, где о наличии ВГЧ-6А или ВГЧ-6 В судят в случае регистрации экспоненциального накопления сигнала флуоресценции в соответствующих зондам каналах. Изобретение может быть использовано для генотипирования вируса герпеса 6-го типа, однако оно не предусматривает возможности обеспечения своевременного определения характера и особенностей течения ОРИ с учетом генотипа ВГЧ-6.

Важной характеристикой оценки эффективности терапии инфекции, вызванной ВГЧ-6 у детей (RU 2646472 С1), является определение вирусной нагрузки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) ВГЧ-6 методом ПЦР в соскобе из эпителия ротоглотки, однако способ предложен без учета патогенеза вируса герпеса 6 типа и не может применяться для прогноза течения осложнения нейроинфекции.

Существует способ определения показаний к проведению противогерпетической терапии при инфекции ВГЧ-6 у детей с острыми респираторными заболеваниями (RU 2641609 С1) на основе проведения ПЦР в режиме «реального времени», где определяют количество копий ДНК ВГЧ-6 и при более 100 копий/10⁵ клеток в крови определяют показания к проведению противогерпетической терапии. Но этот способ не учитывает определение генотипов вируса герпеса 6 типа, а также не предоставляет возможности установить причины развития возможных фебрильных судорог или идиопатической в процессе течения ОРИ с учетом генетической характеристики вируса.

Наиболее близким способом диагностики активных форм ОРИ является подход, описанный группой авторов (Милехина Е.В., Музыка А.Д. Петухова Е.Д. и др. Методы этиологической диагностики инфекции вируса герпеса 6 типа у детей с острыми респираторными инфекциями // Молекулярная диагностика. - 2017. - 1. - С. 222-223), где показана роль выявления ВГЧ-6 в крови у детей, поступающих в стационар с диагнозом направления ОРВИ. Определяют количество вирусного ДНК ВГЧ-6 в крови и в мазке из ротоглотки. Методом ИФА в сыворотке периферической крови выявляют вирусоспецифические AT к АГ герпесвирусов классов IgM (качественное), IgG (полуколичественное, количественное). Однако авторы не приводят данных о наличии сопутствующих вирусных инфекций, вызывающих сходную клиническую картину ОРИ. Также не представлены данные о влиянии генотипов ВГЧ-6 на течение и исход болезни, нет оценки показателей активности инфекционного процесса. В разработанном подходе диагностики ОРИ основным решающим фактором является период инфекционного процесса ВГЧ-6, однако авторы не определяли генотип выявленного вируса и не учитывали его влияние на развитие заболевания. Таким образом, известный способ не обеспечивает диагностики активности вируса ВГЧ-6 у детей с ОРИ, не учитывает причины возможного развития неблагоприятного течения заболевания в зависимости от выявленного генотипа вируса. Таким образом, способ не обеспечивает точности диагностики.

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ диагностики активности инфекции у детей с ОРИ. Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности постановки диагноза при наличии у пациентов идиопатической лейкопении и фебрильных судорог при подозрении на сочетанную герпесвирусную инфекцию за счет проведения комплексной последовательной вирусологической диагностики с оценкой активности ВГЧ-6, его генотипа и его участия в развитии и тяжести течения заболевания.

Это достигается тем, что путем выявления герпесвирусов у детей с ОРИ при идиопатической лейкопенией и фебрильных судорогах при подозрении на сочетанную герпесвирусную инфекцию, авторы предлагают в крови одновременно определять наличие и генотип вируса герпеса 6 типа, его количественные характеристики, IgM антитела, авидность иммуноглобулинов IgG, и при наличии у больного вируса герпеса 6 типа серотипа А с количеством ДНК не менее 10⁴ копий/мл, обнаружении IgM и IgG с индексом авидности менее 40% диагностировать активный герпесвирусный процесс.

В результате многолетнего опыта работы в области диагностики острых респираторных инфекций авторы обнаружили, что разработка диагностики активности сочетанной инфекции у детей с ОРИ дает возможность своевременной оптимизации тактики ведения и терапии таких пациентов с достижением положительной динамики в процессе лечения, что приводит к сокращению сроков пребывания в стационаре и имеет большое медико-социальное значение.

Профессионально изучая на протяжении многих лет высокую частоту встречаемости герпесвирусного инфицирования у пациентов, госпитализированных с диагнозом ОРИ, авторы обнаружили, что значимую роль в определении тяжести заболевания играет только комплексная оценка данных исследований, включающих как молекулярно-биологические и генетические, так и серологических методы диагностики. Именно такой сочетанный диагностический подход может более точно выявлять нюансы вирусогенеза в различные периоды инфекционного процесса, объяснить развитие осложнений в ходе заболевания и с высокой долей вероятности диагностировать активную вирусную инфекцию, как на основе выявляемых вирусных маркеров с помощью ПЦР, генодиагностики, так и показателей иммунного ответа пациента с помощью ИФА.

Авторы обнаружили, что в отличие от прототипа, важным показателем для оценки тяжести течения процесса является определение маркеров активности всех выявляемых у пациента вирусов с определением степени влияния каждого на течение ОРИ. Так, при выявлении у пациента вируса респираторной группы, возможную тяжесть течения заболевания могут создавать герпесвирусы не только при первичном инфицировании, но и при их реактивации, на фоне вируса респираторной группы. Необходимо отметить, что важным достижением авторов стало выявление в крови количества вируса герпеса человека 6 типа, а также его генотипа.

Авторы доказали, что генотип ВГЧ-6 принципиально влияет на характер течения заболевания, а именно, выделяемый у пациентов с ОРИ генотип ВГЧ-6 А ведет к снижению клеточного иммунитета за счет возможного развития идиопатической лейкопении и, как следствие, повышает тяжесть течения заболевания и длительность восстановительного периода, а также является причиной фебрильных судорог. Кроме того, обнаруженные нами в процессе исследований высокие концентрации копий ДНК ВГЧ-6 именно в диагностических концентрациях 10⁴ копий/мл и более (при положительных IgM антителах или IgG с индексом авидности <40% в крови) доказывают активность вирусного процесса, и могут определять неблагоприятный характер течения ОРИ. Мы доказали, что определение у ВГЧ-6 генотипа А является первопричиной неблагоприятных проявлений в ходе заболевания, которые нуждаются в своевременном купировании терапевтическими методами. Выявление IgM антител острого периода или низкоавидных IgG антител, дополнительно доказывают острый, а не латентный период инфекционного процесса, так как выделение ДНК вируса ВГЧ-6 из крови может проходить спустя месяцы после инфицирования.

Таким образом, анализируя результаты комплексных диагностических обследований детей с ОРИ, авторы впервые обнаружили, что такая совокупность отличительных признаков, обеспечивает быструю и точную дифференциальную диагностику активности сочетанной инфекции при ОРИ. Это принципиально новый способ, основанный на комплексной оценке данных вирусологического исследования. Подобного способа в доступной литературе нами не обнаружено.

Способ осуществляется следующим образом: При госпитализации ребенка с острой респираторной инфекцией с признаками идиопатической лейкопении или наличием фебрильных судорог, методом ПЦР проводят стандартный скрининг - тест на наличие возбудителей, вызывающих сходные клинические проявления. Для этого у детей с острыми респираторными инфекциями, одновременно со стандартными исследованиями оценивают наличие в крови ДНК инфекционных возбудителей герпесвирусной группы, наличие которых свидетельствует о сочетанных инфекциях в патогенезе заболевания. Одновременно, в крови методом ПЦР определяют ДНК вируса герпеса 6 типа определяют его генотип с количественными характеристиками, иммуноглобулины класса М, G и авидность, и при выявлении у больного ДНК ВГЧ-6 генотипа А с количеством ДНК не менее 10⁴ копий/мл, обнаружении антител IgM или IgG с индексом авидности менее 40%, диагностируют активный инфекционный герпесвирусный процесс.

Разработанный нами способ диагностики активности сочетанной инфекции был апробирован у 84 пациентов в возрасте от 1 года до 14 лет, поступивших в стационар в острый период заболевания, с диагнозом ОРИ.

Высокая эффективность заявляемого способа проиллюстрирована нижеследующими примерами.

Пример 1.

Ребенок С., 1 год, госпитализирован в клинику ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России 05.10.2018 года с предварительным диагнозом: вирусная инфекция неуточненной этиологии, ОРИ, острый тонзиллофарингит, конъюнктивит. Анамнез заболевания: 4.10. 2018: подъем температуры (Т) до 38.4°С, зафиксированы фебрильные судороги, продолжавшиеся 3 минуты; снижение аппетита, отказ от еды и воды, слюнотечение, заложенность носа, теребит уши, не сосет. При поступлении на отделение: судорог не наблюдалось, температура 38,4°С, вялость, слабость, отказ от еды, питья, снижение мочеиспускания, капризность, плаксивость, заложенность носа, слюнотечение. При осмотре - клиника ОРИ, острый тонзиллофарингит и конъюнктивит. При лабораторном обследовании: в крови методом ПЦР обнаружена ДНК аденовируса, методом ИФА - IgM антитела аденовируса. При исследованиях на обнаружение в крови вирусов герпетической группы обнаружена ДНК ВГЧ-6 типа (генотип А) в концентрации 10⁴ копий/мл и антитела IgG класса с индексом авидности 37%, что характеризовало острый период инфекционного процесса. Посев из носа на флору отрицательный. Посев из зева и носа на BL 3-кратно отрицательный. На основании клинико-анамнестических и лабораторных данных ребенок переносил ОРИ, вызванную аденовирусом в сочетании с ВГЧ-6 (серотип А). На фоне проводимой терапии зарегистрирована положительная динамика. Самочувствие улучшилось. Температура нормализовалась. Катаральные явления уменьшились. Судороги не повторялись. На основании клинико-лабораторных данных диагностировано: ОРИ в сочетании с активным инфекционным герпесвирусным процессом, вызванным ВГЧ-6 (генотип А), протекающим в средне-тяжелой форме. Благодаря применению предложенного способа был уточнен диагноз и выявлена причина осложненного фебрильными судорогами течения инфекционного процесса, которые были купированы применением этиотропной терапией с достижением положительной динамики.

Пример 2.

Больной X., 14 лет, находился в клинике ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России с 24.11. по 21.12.2018. Диагноз: ОРИ неуточненной этиологии, ринофарингит. Из анамнеза заболевания: мальчик 14 лет из семейного контакта по ОРИ поступил на ранних сроках заболевания в тяжелом состоянии с жалобами на судороги, продолжающиеся 3-5 минут, повышение температуры, озноб, учащение пульса, беспокойство, головные боли, слабость, сильный насморк, затруднение носового дыхания. Из анамнеза - ребенок из группы ЧБД, в возрасте 5 лет перенес инфекционный мононуклеоз. По клинико-анамнестическим данным, при поступлении на госпитализацию, ребенок переносил острую респираторную инфекцию, сопровождающуюся фебрильными судорогами, острый ринофарингит, сопутствующий - хроническая инфекция носоглотки. Лабораторные данные: в клиническом анализе крови - ускоренная СОЭ 30 мм/ч, понижение числа лейкоцитов до 3,1×109 Ед/л (норма 4,0×10⁹-9,0×10⁹ Ед/л). Бактериологические исследования: в мазках из зева и носа установлен рост золотистого стафилококка. При проведении исследования методом ПЦР (ОРВИ-скрин) обнаружена РНК RSV и ДНК аденовируса. Остальные вирусы, входящие в ОРВИ-скрин-отрицательные. При проведении дополнительных исследований методом ПЦР в крови обнаружены: ДНК вируса герпеса 6 типа, ДНК цитомегаловируса и ДНК вируса Эпштейна-Барр, активность которых подтверждена, при проведении ИФА, выявлением антител класса IgM на фоне положительного тестирования антител IgG класса. Авидность IgG антител к ВГЧ-6 была низкая; индекс авидности соответствовал показателю - 29%. При проведении генотипирования ДНК вируса герпеса 6 типа выявлен генотип А в концентрации 10⁵ копий/мл. На основании клинико-лабораторных данных установлен диагноз: ребенок переносил сочетанную острую респираторную инфекцию, вызванную RSV и аденовирусом, острый ринофарингит, хроническая инфекция носоглотки, обострение хронических герпесвирусных инфекций, с развитием лейкопении и фебрильных судорог, обусловленных вирусом герпеса человека 6 типа генотипа А. Обнаружение трех герпесвирусов в периоде активации: ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-6 позволило характеризовать форму заболевания как тяжелую. Таким образом, применяемый способ дал возможность выявить причины тяжелого течения заболевания и провести своевременную коррекцию противовирусной этиотропной терапии для быстрого купирования неблагоприятных проявлений.

Разработанный нами способ имеет высокую медико-социальную эффективность за счет возможности своевременного выявления активности инфекционного процесса при сочетанном вирусном инфицировании. Благодаря способу становится возможным точно устанавливать причины развития осложненного течения заболевания, определять генетические свойства вируса, влияющие на характер течения инфекционного процесса и выявлять особенности иммунного ответа организма в острый период заболевания. Получаемые данные комплексного обследования позволяют с первых дней госпитализации начать своевременную адекватную этиотропную противовирусную терапию, ведущую к скорейшей положительной динамике заболевания и, соответственно, сокращению пребывания больного в стационаре на 3-4 койко-дня, обеспечивая положительный экономический эффект для практического здравоохранения.