Способ прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С

Изобретение относится к области медицины, а именно инфектологии, гастроэнтерологии и патологической анатомии, может быть использовано для прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени у больных с естественным течением хронического гепатита С.

Актуальность прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С обусловлена широкой распространенностью инфицирования вирусом гепатита С и охватом более чем 170 миллионов человек по всему миру, приобретающей характер глобальной проблемы здравоохранения Примерно у 70-80% инфицированных вирусом гепатита С развивается хроническая инфекция, которая в свою очередь является лидирующей причиной заболеваемости и смертности среди всех болезней печени, приводя к ее фиброзу, циррозу и гепатоцеллюлярному раку. Ожидается, что количество больных хроническим гепатитом С значительно возрастет в ближайшие десятилетия и может стать одной из главных проблем здравоохранения во всем мире, что делает изучение этой проблемы чрезвычайно актуальной.

Развитие фиброза в печени происходит вследствие избыточного накопления экстрацеллюлярного матрикса, прежде всего, коллагена, и является типовым патологическим процессом в качестве ответной реакции на хроническое повреждение при естественном течении хронического гепатита С. Вместе с тем, скорость развития фиброза печени у больных хроническим гепатитом С может существенно варьировать и приводить к формированию цирроза печени в период времени от 1-2 до 10-20 и более лет. Различная скорость развития фиброза печени при естественном течении хронического гепатита С обусловлена как свойствами патогена, так и особенностями иммунной системы макроорганизма в условиях сложного патогенеза хронической HCV-инфекции. Определение стадии фиброза является ключевым моментом в определении тактики лечения и прогнозировании течения хронического гепатита С, а объективное количественное определение показателей, характеризующих прогностически важные типовые патогологические процессы, позволит осуществлять прогнозирование неблагоприятного течения фиброза печени у больных хроническим гепатитом С.

К наиболее важным прогностическим критериям большинство исследователей относят генотип вируса гепатита С, обусловившего развитие хронического гепатита и его гистологическая активность. К прогностически неблагоприятным относят 3 генотип вируса гепатита С и высокую гистологическую активность хронического гепатита.

Существующая практика морфологической оценки гистологической активности хронического гепатита, являющейся важным патогенетически обусловленным компонентом и необходимым условием для прогрессирования фиброза печени, основана на определении полуколичественного показателя выраженности повреждения печени в разных отделах печеночных долек с вычислением интегрального полуколичественного показателя.

Вместе с тем, существующие морфологические методы оценки гистологической активности хронического гепатита основываются на показателях, визуально определяемых исследователем и являются в определенной степени субъективными.

Известен «Способ оценки степени фиброза печени у детей раннего возраста с помощью индекса APRI» (RU №2585387) В основе метода лежит количественное определение содержание ГГТ, ТФР-β1, ТИМП-1 и комплекс ММП-9/ТИМП-2 в сыворотке крови с последующим вычислением интегрального показателя, характеризующего вероятность наличия фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С. Однако, предлагаемый способ предназначен лишь для неинвазивной диагностики степени выраженности фиброза печени, но не предусматривает прогнозирование риска его развития, то есть не может быть использован для прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени у больных хроническим гепатитом С. Кроме того, способ предназначен для использования у детей младшего возраста и не может быть применен у взрослых пациентов.

Известен «Способ неинвазивного определения стадии фиброза печени у пациентов с хроническим вирусным гепатитом» (RU №2639432), предусматривающего определение широкого спектра биохимических показателей крови, ультразвуковое определение размеров паренхиматозных органов брюшной полости, и путем вычисления интегрального показателя, диагностируют стадию фиброза печени. Однако предлагаемый способ не позволяет определить вероятность неблагоприятного течения хронического гепатита, поскольку предназначен для определения стадии заболевания в период обследования пациента.

Известен «Способ прогнозирования динамики фиброза печени у пациентов с хроническим гепатитом С, генотипом 1, не ответивших на лечение пегилированными интерферонами и рибавирином» (RU №2623151), согласно которому у пациентов с группой крови Аβ (II), у которых двухкомпонентная терапия хронического гепатита С, включающая пегилированные интерфероны и рибаверин, оказалась неэффективной, выявление полиморфизма гена IL28B в 100% прогнозируется прогрессирование фиброза печени. Однако, предложенный способ может быть использован только у пациентов с лечебным патоморфозом хронического гепатита С и не может быть использован у пациентов с его естественным течением.

Известен «Способ диагностики цирроза и/или фиброза печени у больных, инфицированных вирусом гепатита С или с коинфекцией вирус гепатита С и вирус иммунодефицита человека» (WO №2010125220). В основе предлагаемого способа лежит количественное определение содержание ММР2, ASP в сыворотке крови, а также содержание тромбоцитов в крови у больных хроническим гепатитом С и пациентов с коинфекцией вирусом иммунодефицита человека. Полученные показатели подвергаются компьютерному анализу и на основании вычисления интегрального показателя определяется степень выраженности фиброза печени. Однако, предложенный способ не предусматривает прогнозирование неблагоприятного течения хронического гепатита С в виде прогрессирования фиброза печени.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является «Способ определения скорости развития фиброза в печени при вирусных гепатитах В и С у лиц, употребляющих эфердон» (RU №2252416).

Предложенный способ предполагает выполнение иммуногистохимического исследования в биоптате печени с определением пролиферативной активности (по экспрессии Ki-67) гепатоцитов и синусоидальных клеток и последующим вычислением их соотношения. Величина вычисленного интегрального показателя соотношения пролиферативной активности паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени является основанием для прогнозирования скорости развития фиброза печени. Однако, предложенный способ ограничен в применении употреблением пациентами эфердона, к лицам, не употребляющим психоактивные препараты, предложенный способ прогнозирования применен быть не может. Кроме того, для прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С авторами не учитывался генотип вируса гепатита С и выраженность повреждения паренхимы печени, с которыми, по мнению большинства исследователей, связан патологический фиброгенез в печени.

Устранение указанных недостатков может быть осуществлено применением предлагаемого авторами принципиально нового способа прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени у больных хроническим гепатитом С.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности диагностики за счет аппаратного иммуногистоморфометрического определения содержания CD8-позитивных клеток в паренхиме печени у больных хроническим гепатитом С.

Это достигается тем, что путем определения выраженности клеточно-опосредованного иммунного повреждения паренхимы печени, авторы в иммуногистоморфометрическом методе проводят количественное определение абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы биоптата печени, и при содержании более 200 CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. паренхимы печени и инфицировании 3 генотипом вируса гепатита С, прогнозируют неблагоприятное течение фиброза печени при хроническом гепатите С

Существующие и использующиеся в настоящее время методики полуколичественного определения выраженности гистологической активности хронического гепатита недостаточно точны и в известной мере субъективны. В этой связи крайне важным является точное определение и количественный учет непаренхиматозных клеточных популяций в печени, в том числе клеточных популяций, имеющих прогностическое значение.

Исходя из этого авторы обнаружили, что количественное аппаратное иммуногистоморфометрическое определение содержания различных непаренхиматозных клеточных популяций в паренхиме печени позволяет существенно объективизировать анализ имеющихся патологических изменений и на основании полученных показателей осуществлять прогнозирование неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С.

Авторы впервые показали, что прогнозировать неблагоприятное течение фиброза печени при хроническом гепатите С возможно при осуществлении количественного аппаратного иммуногистоморфометрического определения содержания CD8-позитивных лимфоцитов в паренхиме печени.

Авторами показано, что на основании вычисления количественного показателя абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. паренхимы биоптата печени, получаемого при иммуногистохимическом исследовании и аппаратном иммуногистоморфометрическом анализе, и превышении определяемого показателя более 200 CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени, прогнозируют неблагоприятное течение фиброза печени.

Авторы впервые показали, что результаты, выражаемые в числовом значении, нами установленными, указывают на значимость таких изменений в патогенезе естественного течения хронического вирусного гепатита С и позволяют осуществлять статистически обоснованное прогнозирование неблагоприятного течения фиброза печени в клинической практике и при проведении сопоставлений в научных исследованиях.

Принципиально новым результатом разработанного авторами метода является количественное определение с использованием иммуногистохимического и иммуногистоморфометрического методов абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы биоптата печени, отражающей наличие и тяжесть клеточно-опосредованного иммунного повреждения печени. При значении показателя более 200 CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени, прогнозируют неблагоприятное течение фиброза печени при естественном течении хронического гепатита С, вызванного 3 генотипом вируса гепатита С.

Преимуществом и новизной предлагаемого метода является количественное определение с использованием гистологического и иммуногистоморфометрического методов абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы биоптата печени, отражающей наличие и тяжесть клеточно-опосредованного иммунного повреждения печени. Так авторы обнаружили: при значении указанного показателя более 200 CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени, прогнозируют неблагоприятное течение фиброза печени.

Преимуществом предлагаемого метода является то, что для количественного подсчета абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы биоптата печени применяется иммуногистохимический метод, используемый в рутинной работе гистологических лабораторий, то есть способ не предполагает выполнения дополнительных трудозатратных исследований, а применение предложенного воспроизводимого и лишенного субъективности способа позволяет существенно объективизировать степень выраженности клеточно-опосредованного иммунного повреждения печени.

Для реализации предложенного метода образцы печени фиксировались 10% нормальным формалином, осуществлялись гистологическая проводка, имбибиция парафином, заливка в парафин и микротомия по общепринятым методикам. Срезы ткани печени помещались на предметные стекла, окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофкуксином по ван Гизону и заключались под покровные стекла. Иммуногистохимические исследования выполнялись аппаратным методом с использованием мьшшных или кроличьих антител к CD3, CD8, CD68 и к alfa-SMA, универсальной иммуногистохимической системы Ultra Vision Quanto DAB (Thermo, США) и автоматического иммуностейнера Autostainer 480 (Thermo, США). Гистологическая активность хронического гепатита и стадия заболевания определялись полуколичественным методом по шкале METAVIR. Гистологические и иммуногистохимические препараты тотально сканировались при помощи цифрового сканера Pannoramic (3DHISTECH, Венгрия). Пример фрагментов сканированных гистологического (справа, окраска гематоксилином и эозином) и иммуногистохимического (слева, иммуногистохимическая реакция, CD8+ лимфоциты, коричневое окрашивание) препаратов - продемонстрирован на рисунке 1.

Количественный учет содержания непаренхиматозных клеточных популяций в ткани печени осуществлялся с помощью морфометрической программы QuantCenter 2.0 (3DHISTECH, Венгрия) - рисунок 2.

Таким образом, предложенный авторами способ отличается новизной, неочевидностью, изобретательским уровнем, что обеспечивает положительный результат.

В доступной нам литературе подобного способа прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени у больных хроническим гепатитом С не обнаружено, а совокупность предложенных авторами признаков позволяет нам заявить способ как заявочный материал на изобретение.

Объектом исследования явились биптаты печени 70 больных хроническим гепатитом С в возрасте от 18 до 60 лет, полученные при диагностической чрескожной пункционной биопсии.

С помощью метода иммуногистохимии с последующим иммуногистоморфометрическим анализом производилась количественная оценка популяционного (CD3+Т-лимфоциты) и субпопуляционного (CD8+T-лимфоциты) состава патологической клеточной инфильтрации и стромальных клеток (CD68-позитивные клетки Купфера, alfa-SMA-позитивные активированные звездчатые клетки). Далее был осуществлен корреляционный анализ зависимости данных показателей от генотипа вируса, степени выраженности фиброза и гистологической активности.

Использование иммуногистоморфометрического метода позволило получить абсолютные показатели, пригодные к статистической обработке и адекватному сравнительному анализу. Так, анализ изучаемых показателей показал, что возрастание индекса гистологической активности закономерно сопровождается увеличением количества внутрипеченочных CD8+лимфоцитов, что сочетается с увеличением стадии фиброза (таблица 1).

Наблюдалась положительная корреляционная взаимосвязь между выраженностью цитолитического синдрома и стадией фиброза. Однако достоверной связи между ИГА и выраженностью цитолиза выявлено не было (таблица 2).

Однако у больных с высокой гистологической активностью и выраженным фиброзом наблюдалась положительная взаимосвязь между вирусной нагрузкой и количеством CD3+ лимфоцитов, CD8+ лимфоцитов и SMA+ звездчатых клеток (таблица 3 и 4).

Анализ клинической и морфологической картины показал более выраженное повреждение ткани печени при инфицировании 3 генотипом вируса гепатита С, что подтверждалось достоверно более высоким содержанием CD8+ лимфоцитов в ткани печени, более высокой гистологической активностью и выраженностью цитолитического синдрома, чем при инфицировании вирусом гепатита С 1 генотипа (таблица 5).

Кроме того, более выраженное клеточно-опосредованное иммунное повреждение при инфицировании 3 генотипом вируса гепатита С закономерно влечет за собой более выраженную активацию SMA + звездчатых клеток, а при инфицировании 1 генотипом характерна более выраженная активация CD68+ макрофагов (таблица 6).

Таким образом, исходя из клинической и патогенетической значимости, целесообразным является выделение порогового прогностически значимого значения абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов, равного 200 клеткам, отражающих выраженность клеточно-опосредованного иммунного повреждения печени в 1 кв.мм. среда паренхимы биоптата печени.

Эффективность предлагаемого способа количественного иммуногистоморфометрического определения абсолютного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы биоптата печени для прогнозирования неблагоприятного течения фиброза печени при хроническом гепатите С может быть подтверждена клиническими примерами.

Пример 1.

Больной Р., 33 лет. Антитела к вирусу гепатита С (HCVAb) выявлены при плановой госпитализации по поводу оперативного лечения пахово-мошоночной грыжи. Жалоб не предъявлял. В анамнезе эпизодическое парентеральное употребление наркотических веществ. При биохимическом обследовании активность АлАт 116 ед/л, общий билирубин 26 мкмоль/л, методом ПЦР выделен HCV 3 генотип. В ходе дальнейшего обследования выполнена пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании определена умеренная гистологическая активность хронического гепатита (А2 по METAVIR) и слабая выраженность фиброза печени (F1 по METAVIR). При иммуногистохимическом исследовании биоптата печени определено наличие 260 CD8+ лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени. Наличие более 200 CD8+ лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени у больного хроническим гепатитом С, инфицированным 3 генотипом позволило прогнозировать неблагоприятное течение фиброза печени. Выполненным спустя 1 год методом эластометрии (ФиброСкан) документировано существенное возрастание степени выраженности фиброза печени, соответствующей стадии F3 (тяжелый фиброз) при сохранении умеренного характера цитолитического синдрома (показатель активности АлАт в сыворотке крови составил 130 ед/л). Пример демонстрирует неблагоприятное течение фиброза печени у пациента, больного хроническим гепатитом С, вызванного 3 генотипом вируса с невысокой биохимической активностью, но высоким содержанием цитотоксических лимфоцитов в паренхиме печени, патогенетически обусловившим существенное прогрессирование фиброза печени.

Пример 2.

Больной Б, 28 лет, хронический гепатит С выявлен при плановом обследовании, способ и время инфицирования не установлены. В сыворотке крови выявлены HCVAb, методом ПЦР выделен HCV 1 генотипа. При биохимическом обследовании активность АлАт 96 ед/л, общий билирубин 20 мкмоль/л. Выполнена пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании определена умеренная гистологическая активность хронического гепатита (А2 по METAVIR) и слабая выраженность фиброза печени (F1 по METAVIR). При иммуногистохимическом исследовании биоптата печени определено наличие 116 CD8+ лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени. Наличие менее 200 CD8+ лимфоцитов в 1 кв.мм. среза паренхимы печени у больного хроническим гепатитом С, инфицированным 1 генотипом позволило прогнозировать благоприятное течение фиброза печени. Выполненное эластометрическое исследование печени (ФиброСкан) спустя 1 год показало отсутствие прогрессии фиброза УЗ плотность печени соответствовала стадии F1, в биохимическом анализе крови сохранялся умеренный характер цитолитического синдрома (показатель активности АлАт в сыворотке крови составил 105 ед/л). Пример демонстрирует благоприятное течение фиброза печени у пациента, больного хроническим гепатитом С, вызванного 1 генотипом вируса с умеренной биохимической активностью и относительно невысоким содержанием цитотоксических лимфоцитов в паренхиме печени, что обусловило отсутствие выраженной прогрессии фиброза печени.

Таким образом, применение предложенного способа позволяет существенно объективизировать определение гистологической активности хронического гепатита С и осуществлять прогнозирование неблагоприятного течения фиброза печени у больных хроническим гепатитом С с использованием общепринятых методик, что определяет его эффективность и воспроизводимость.