Способ дифференциальной диагностики менингитов у детей

Изобретение относится к области медицины, а именно, клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных менингитов.

Актуальность разработки новых диагностических критериев при менингите у детей обусловлена тяжелым течением заболевания, с частым формированием неврологического дефицита в стадии реконвалесценции. Этиологическими факторами менингитов в большинстве случаев являются вирусы и бактерии, однако первичная скрининговая дифференциальная диагностика вирусной, или бактериальной природы заболевания вызывает трудности, что препятствует своевременному назначению этиотропной терапии. Решающее значение для диагностики менингитов имеют исследования состава цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), а именно содержания общего белка и числа клеток с их дифференциацией на поли- и мононуклеары Принято считать, что значительное увеличение числа клеток (плеоцитоз) (более 1000 кл/мкл) с преобладанием полинуклеаров, увеличение содержания общего белка ликвора (>1 г/л), указывают на бактериальный гнойный менингит (БГМ), тогда как умеренный плеоцитоз (до 1000 кл/мкл) с преобладанием мононуклеаров и незначительное увеличение общего белка ликвора - на вирусный менингит (ВМ). Однако начальные стадии БГМ могут сопровождаться низким плеоцитозом ликвора с равным количеством поли- и мононуклеаров а вирусный менингит сопровождается увеличением плеоцитоза свыше 1000 кл/мкл, что ограничивает использование плеоцитоза в качестве дифференциально-диагностического критерия вирусных и бактериальных менингитов.

Клетки ликвора обеспечивают реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа, направлены на уничтожение возбудителя нейроинфекционного заболевания и имеют качественные и количественные отличия при вирусной, или бактериальной природе менингита. Особый интерес представляют исследования характеристик адаптивного иммунного ответа, обеспечиваемого, прежде всего, лимфоцитами различных субпопуляций. Однако в современной литературе, исследования количественных характеристик лимфоцитов ликвора немногочисленны, что обусловлено их относительно низким, по сравнению с кровью, содержанием.

В современной литературе имеются сведения о субпопуляционном составе лимфоцитов ликвора при некоторых неврологических заболеваниях, включая ВМ и БГМ. Авторы отмечают информативность исследования лимфоцитарного пула ликвора для оценки состояния адаптивного иммунного ответа, однако не рассматривают возможность использования этих показателей с целью дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных менингитов.

На сегодняшний день большинство известных способов дифференциальной диагностики менингитов основано на исследовании биохимических параметров ЦСЖ. Известен способ дифференциальной диагностики вирусного и бактериального менингита, основанный на определении лактоферрина в ЦСЖ. Способ дифференциальной диагностики бактериальных и вирусных менингитов. Патент на изобретение RU №2323444). Так при значениях лактоферрина в ЦСЖ 0,1 мг/л диагностируют вирусный менингит, при 0,5 мг/л и выше - бактериальный менингит. Метод не обеспечивает точность диагностики, так как возникает сложность в интерпретации промежуточных значений (от 0,11 до 0,49 мг/л). При использовании данного способа необходим достаточно большой объем ликвора (1-2 мл), что зачастую является невозможным при проведении люмбальной пункции у детей.

Известен «Способ дифференциальной диагностики менингитов у детей» (RU №2541150), основанный на определении в ликворе уровня гаптоглобина. При концентрации гаптоглобина равной или менее 0,7 мг/дл, диагностируют вирусный менингит, при концентрации свыше 0,7 мг/дл - бактериальный менингит. Определение гаптоглобина в ликворе характеризует патобиохимические изменения при ВМ и БГМ, но не оценивает иммунологические реакции, вызванные внедрением вируса, или бактерии в оболочки и ткани мозга.

Известен метод дифференциальной диагностики вирусного и бактериального менингита, состоящий в определении показателей микробицидной активности нейтрофильных лейкоцитов: ферментов миелопероксидазы, цитохромоксидазы, кислой фосфатазы в ликворе больных методом спектрофотометрического анализа «Способ дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов у детей». (RU №2499995). Предлагаемые авторами методы лабораторного анализа требуют длительной и многостадийной пробоподготовки, что не позволяет быстро провести дифференциальную диагностику. Использование этого способа включает определение трех ферментов, характеризующих микробицидную активность нейтрофильных лейкоцитов, обуславливающих реакции врожденного иммунитета, и не затрагивает показатели адаптивного иммунного ответа в ликворе.

Близким к предлагаемому способу являются результаты исследования реакций адаптивного иммунного ответа в ликворе, изложенные в работе Kowarik М.С. et. al. (Immune cell subtyping in the cerebrospinal fluid of patients with neurological diseases. // J. Neuro. 2014 (261), 130-143). Авторами исследован субпопуляционный состав лимфоцитов ликвора методом проточной цитометрии при различных заболеваниях центральной нервной системы у взрослых пациентов, включая вирусные (17 человек) и бактериальные менингиты (13 человек). Группы были неоднородны по этиологии. При БГМ установлена менингококковая этиология (2), пневмококковая (4), гемофильная (1), стрептококковая (1), туберкулезная (3), листериозная (1), кампиллобактер (1). Группа больных ВМ также была разнообразной по этиологической структуре и включала двух пациентов с энтеровирусной этиологией заболевания, 8 человек с вирусом простого герпес 1-2 типа, 6 человек с вирусом варицелла зостер и 1-го пациента с цитомегаловирусной этиологией заболевания. Авторы рассчитывали содержание В-лимфоцитов по отношению ко всем лейкоцитам ликвора, включая моноциты, нейтрофилы и другие клетки, что, наряду с неоднородностью групп пациентов по этиологической структуре, не позволило получить достоверных различий между группами. Таким образом, в работе Kowarik М.С. и соавторов исследован субпопуляционный состав лимфоцитов ликвора методом проточной цитометрии, однако не выявлены информативные для диагностики субпопуляции лимфоцитов ликвора и конкретные диапазоны их значений, которые могли быть использованы для дифференциации вирусного и бактериального менингита у детей.

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ дифференциальной диагностики менингитов у детей. Технический результат, достигаемый в данном способе заключается в повышении точности постановки

Это достигается тем, что путем проведения проточной цитометрии, в остром периоде заболевания исследуют субпопуляционный состав лимфоцитов ликвора: CD3+ T-лимфоциты, CD3-CD16+56 натуральные киллеры, CD3-CD19+ В-лимфоциты, определяют отношение содержания В-лимфоцитов к сумме основных популяций лимфоцитов ликвора и при относительном содержании В-лимфоцитов выше 2,72% диагностируют бактериальный менингит, при значениях равных или ниже 2,72% - вирусный.

На протяжении многих лет занимаясь проблемой ликворологических исследований и их использования в клинической лабораторной диагностике, нами была установлена недостаточная эффективность стандартных исследований ликвора для дифференциальной диагностики вирусной, или бактериальной природы заболевания, обусловленная наличием перекрестных значений общего белка и плеоцитоза при вирусных и бактериальных менингитах с равным соотношением моно- и полинуклеаров. Стандартное микроскопическое исследование осадка ликвора не позволяет дифференцировать отдельные субпопуляции лимфоцитов, выполняющие различные функции в реакциях адаптивного иммунного ответа.

Нами обнаружена и доказана важная роль субпопуляций лимфоцитов, а именно Т-лимфоцитов (CD3+), натуральных киллеров (CD3-CD16+CD56) и В-лимфоцитов (CD3-CD19+) в диагностике менингита и необходимость их определения в ликворе для дифференциации вирусной или бактериальной его природы.

Авторы впервые доказали, что максимальной диагностической чувствительностью и специфичностью обладают В-лимфоциты, обеспечивающие гуморальный иммунный ответ, хотя и другие субпопуляции лимфоцитов имеют достоверные отличия при ВМ и БГМ, что делает возможным и необходимым их комплексное исследование.

Выбор лабораторных показателей не был очевидным и был получен в результате многочисленных экспериментальных исследований клеточного осадка ликвора методом проточной цитометрии, позволивших обнаружить значительные изменения в субпопуляционном составе лимфоцитов.

Авторы впервые в образцах ликвора детей с острыми менингитами определили субпопуляции лимфоцитов методом проточной цитометрии

Субпопуляционный состав лимфоцитов ликвора исследован у 73 детей в возрасте от 3 месяцев до 18 лет, находившихся в стационаре ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России в период с 2012-2018 год. Диагноз «вирусный менингит» установлен у 43 детей, бактериальный менингит - у 30 детей. Этиологический диагноз был верифицирован с применением новейших бактериологических и серологических методов в лабораториях Центра, (руководитель отдела молекулярной микробиологии и эпидемиологии д.м.н. проф. Сидоренко С.В.; руководитель отдела вирусологии и молекулярно-биологических методов исследования д.б.н. Мурина Е.А.). У большинства детей с ВМ установлена энтеровирусная этиология (n=40), у двух - смешанная (ЭВ+Парвовирус) и 1-го цитомегаловирусная. Из 30-ти детей с БГМ у 19 установлена менингококковая этиология, у 6 - гемофильная, у 5 - стрептококковая.

При поступлении у всех пациентов обнаружены клинические признаки острого нейроинфекционного заболевания, встречающиеся как при бактериальной, так и при вирусной природе заболевания. При лабораторном исследовании ликвора показатели общего белка и цитоза в среднем были выше у пациентов с бактериальным менингитом по сравнению с вирусным менингитом, однако, было отмечено перекрывание показателей в широком диапазоне (табл. 1).

Так, минимальное значение цитоза при БГМ составляло 66 кл/мкл, при ВМ значения могли достигать 1592 кл/мкл. В 23% случаев при вирусном менингите и 20% при бактериальном менингите наблюдался смешанный плеоцитоз, иногда с преобладанием не характерных для данных нозологических форм клеточных популяций. Так, в большинстве случаев смешанного плеоцитоза при вирусном менингите преобладали нейтрофилы. В половине случаев смешанного плеоцитоза при БГМ в ликворе преобладали мононуклеары. Таким образом, данные стандартного анализа ликвора часто затрудняли дифференциальную диагностику вирусного и бактериального менингита. В связи с этим нами было детально проанализировано относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов ликвора с целью поиска значимых дифференциально-диагностических критериев (табл. 2).

* - выборки статистически достоверно различаются (уровень достоверности Р<0,05).

Для выбора наиболее диагностически значимого показателя проведен РОК анализ чувствительности и специфичности исследованных субпопуляций лимфоцитов ликвора. Наиболее значимыми показателями чувствительности и специфичности для дифференциальной диагностики вирусного и бактериального менингита обладало относительное содержание В-лимфоцитов (CD3-CD19+). Установлено, что относительное содержание В-лимфоцитов в ликворе в остром периоде заболевания выше 2,72% было характерно для бактериального менингита, равное, или менее 2,72% - для вирусного. Чувствительность и специфичность данного критерия составляют 100%.

Предложенный способ осуществляется следующим образом. После проведения диагностической люмбальной пункции у пациентов с подозрением на менингит и стандартного анализа ликвора, ликвор центрифугируют 5 минут при 1600 об/минуту для осаждения клеток, снимают надосадок, оставляя около 100 мкл ликвора с осажденными клетками. В ресуспендированном осадке проводят фенотипирование лимфоцитов по поверхностным маркерам на проточном цитофлуориметре FACSCalibur фирмы Beckton Dickenson (BD), либо ином проточном цитофлуориметре. Используют стандартный набор реагентов MultiTEST (BD) с 4-х цветной панелью антител: CD3/CD8/CD45/CD4 и CD3/CD16+CD56/CD19, меченных флуорохромами. Модификацией стандартного протокола, разработанного для крови, в случае исследования ликвора является отсутствие фазы лизирования эритроцитов. С учетом преаналитического этапа и модификацией метода для анализа лимфоцитов ЦСЖ пробоподготовка занимает 20-25 минут. После пробоподготовки материал анализируется на проточном цитометре с применением программного обеспечения MaltiSET или CellQuest Pro BD (USA). Обработка данных осуществляется с помощью специализированных программ FlowJo или ее аналогов. В ликворе пациентов определяют относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов (CD3+T-лимфоциты, CD3-CD16+CD56+ натуральные киллеры, CD3-CD19+ В-лимфоциты). При относительном содержании В-лимфоцитов ликвора выше 2,72% диагностируют бактериальный менингит, при значениях равных или ниже 2,72% - вирусный.

Длительность проведения анализа, от момента доставки ликвора в лабораторию до получения результатов - 1-1,5 часа, тогда как при использовании стандартных методов этиологической диагностики (микробиологических, полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа) верификация возбудителя была проведена не ранее суток после поступления биологического материала.

Эффективность предлагаемого способа дифференциальной диагностики менингита может быть подтверждена на конкретных клинических примерах.

Пример №1. Больная К. 4 года. Поступила в ФГБУ ДНКЦИБ на 2-е сутки заболевания с диагнозом «остаточные явления острого респираторного заболевания, подозрение на менингит». В день поступления проведена диагностическая люмбальная пункция. Полученный ликвор бесцветный, прозрачный. Общий белок - 0,377 г/л. Цитоз - 98 кл/мкл: нейтрофилы - 27 кл/мкл, мононуклеары - 71 кл/мкл. Незначительно повышенный общий белок ликвора в совокупности с мононуклеарным плеоцитозом указывали на менингит, предположительно вирусной природы. Для подтверждения диагноза проведено иммунофенотипирование лимфоцитов ликвора методом проточной цитометрии. Относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов составило: CD3+ Т-лимфоцитов - 97,33%, НК (CD3-CD16+56+) - 2,7%, В-лимфоцитов - 0,07%. Относительное содержание В-лимфоцитов в ликворе острого периода заболевания было характерным для вирусного менингита, что в дальнейшем нашло подтверждение при проведении вирусологической диагностики. Методом ПЦР в режиме «реального времени» в ликворе выявлена РНК энтеровируса, по результатам типирования выявлены антигены энтеровируса 68. Диагноз при выписке - энтеровирусный серозный менингит.

Пример №2. Больной Т. 8 месяцев. Доставлен в стационар на 5-е сутки после начала заболевания с подозрением на менингоэнцефалит. Диагностическая пункция проведена на 2-е сутки после госпитализации. Стандартные показатели: ликвор бесцветный, мутный, цитоз - 1708 кл/мкл, белок - 0,75 г/л, нейтрофилы 1491 кл/мкл, мононуклеары - 205 кл/мкл, макрофаги - 108 кл/мкл, плазматические клетки - 1,3 кл/мкл. Нейтрофильный плеоцитоз указывал на бактериальную природу заболевания, однако содержание общего белка ликвора было незначительно увеличено. При иммунофенотипировании лимфоцитов ликвора методом проточной цитометрии установлено, что относительное содержание В-лимфоцитов резко увеличено до 37,2%. Т-лимфоциты составляют 60,1%, НК - 2,7%. Полученные результаты указывали на бактериальную природу заболевания, что нашло подтверждение при верификации возбудителя методом ПЦР в режиме «реального времени» и в реакции латекс-агглютинации (N.miningitidis В). На основании клинико-лабораторных данных был поставлен диагноз: генерализованная менингококковая инфекция серогруппы В, гнойный менингит, менингококкцемия.

Пример №3. Больной Ж. 9 лет 8 месяцев. В стационар ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России поступил на 2-е сутки заболевания с подозрением на менингит. Общее состояние тяжелое за счет общемозгового синдрома, температура тела 36,8 C°. Менингеальные симптомы положительные. Диагностическая пункция произведена в день поступления. Ликвор бесцветный, прозрачный. Общий белок - 0,48 г/л, цитоз - 301 кл/мкл, нейтрофилы 157 кл/мкл, мононуклеары - 144 кл/мкл. Смешанный характер плеоцитоза в совокупности с тяжелым состоянием пациента не позволяли однозначно поставить диагноз. В качестве дополнительного лабораторного критерия проведено иммунофенотипирование лимфоцитов ликвора методом проточной цитометрии. Относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов составило: Т-лимфоцитов - 95,8%, НК - 3,8%, В-лимфоцитов - 0,4%. Относительное содержание В-лимфоцитов в ЦСЖ острого периода пациента указывало на вирусную природу менингита. В дальнейшем это было подтверждено результатами этиологической верификации возбудителя. В ЦСЖ методом ПЦР в режиме «реального времени» обнаружена РНК энтеровируса. Диагноз: Серозный энтеровирусный менингит.

Пример №4. Больной Л. 10 месяцев 10 дней. Поступил в стационар ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России на 2-е сутки заболевания. Общее состояние средней тяжести за счет общеинфекционного синдрома, температура тела 38 C°. Менингеальные симптомы отрицательны. На 3-й сутки произведена диагностическая люмбальная пункция. Ликвор бесцветный, мутноватый. Общий белок - 1,14 г/л. Цитоз - 1005 кл/мкл, нейтрофилы 467 кл/мкл, мононуклеары - 520 кл/мкл, макрофаги - 10,7 кл/мкл, плазматические клетки - 4,3 кл/мкл, гистиоциты - 3,7 кл/мкл. Смешанный характер плеоцитоза не позволял с уверенностью судить о природе заболевания. Было проведено иммунофенотипирование лимфоцитов ликвора методом проточной цитометрии. Относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов составило: Т-лимфоцитов - 81,0%, НК - 10,2%, В-лимфоцитов - 8,8%. Относительное содержание В-лимфоцитов в ЦСЖ острого периода пациента указывало на бактериальную природу менингита. Диагноз был подтвержден результатами верификации возбудителя методом ПЦР в режиме «реального времени». В ликворе пациента обнаружена ДНК Streptococcus pneumoniae. Диагноз: Пневмококковый менингит.

Применение данного способа позволяет на раннем этапе заболевания дифференцировать его вирусную, или бактериальную природу, своевременно проводить обоснованную этиотропную терапию, тем самым, улучшая результаты лечения и исходы бактериальных и вирусных менингитов у детей.