Способ создания тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида)

Изобретение относится к медицине, в частности к тканевой инженерии, и может быть использовано при создании тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида).

Распространенность сосудистых заболеваний и необходимость создания новых материалов для проведения операций на сосудах привели к большому количеству исследований, конечной целью которых является создание искусственной артерии или вены. Используемые в настоящее время синтетические протезы не обладают способностью к ремоделированию и росту, что создает, в частности, проблему повторных вмешательств в детской хирургии по поводу врожденных пороков сердца и сосудов.

Наиболее перспективным направлением исследований является создание тканеинженерного сосудистого имплантата (ТИСИ), т.е. искусственного сосуда, полученного методами тканевой инженерии, сосуда, который, постепенно трансформируясь, приобретал бы структуру и функцию естественного сосуда. Оптимальным результатом такого процесса должно стать развитие чувствительности клеточных составляющих имплантата к нейрогуморальному воздействию со стороны организма реципиента, способность к ремоделированию и росту, что решит многие проблемы сосудистой хирургии.

Наиболее перспективным способом разработки ТИСИ является классический метод использования биодеградируемых полимерных матриц [L'Heureux N, Dusserre N, Marini A, Garrido S, de la Fuente L, McAllister T. Technology Insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2007; 4(7): 389-395. doi: 10.1038/ncpcardio0930]. Принцип методики вытекает из основной концепции создания любого тканеинженерного органа, которая предполагает использование биоразлагаемой матрицы, клеточного материала и специфических сигналов, моделирующих активность и судьбу клеток после вживления имплантата в организм реципиента [Langer R, Vacanti J. Tissue engineering. Science. 1993; 260(5110):920-926. doi: 10.1126/science.8493529]. Предполагается, что далее на фоне биодеградации волокон полимера произойдет образование сосудистой стенки de novo. Известно, что техника посева клеток является ключевым моментом в разработке ТИСИ.

В настоящее время разработан целый ряд методик посева и культивирования клеток на матрицах, но большинство из них занимает слишком много времени и малоприменимы в клинике [Yow К, Ingram J, Korossis S, Ingham E, Homer-Vanniasinkam S. Tissue engineering of vascular conduits. Br. J. Surg 2006; 93(6):652-661. doi:10.1002/bjs.5343]. Для масштабного производства ТИСИ необходим дешевый, надежный и эффективный способ посева.

Известен статичный способ посева клеток на матрицы. Такой вариант посева заключается в пассивном нанесении пипеткой клеточного материала на внутреннюю и внешнюю поверхности матрицы [Villalona G.A., Udelsman В., Duncan D.R., McGillicuddy Е., Sawh-Martinez R.F., Hibino N.. Painter Ch., Mirensky Т., Erickson В., Shinoka Т., Breuer Ch.K. Cell-seeding techniques in vascular tissue engineering. 2010. Tiss.Eng. B: Reviews. 16: 341-350], в результате чего не удается добиться равномерного распределения клеток как на поверхностях, так и в объеме матрицы.

Данный способ прост в использовании, однако, эффективность посева крайне низкая.

Также известен вакуумный способ посева клеток на матрицы, который заключается в том, что под действием искусственно создаваемого в пробирке вакуума происходит покрытие клетками внутренней или внешней поверхности трубчатой матрицы. [Chen М., Michaud Н., Bhowmick S.J. Controlled vacuum seeding as a means of generating uniform cellular distribution in electrospun polycaprolactone (PCL) scaffolds. Biomech Eng. 2009 Jul; 131(7):074521. Doi: 10.1115/1.3173283].

Таким образом, указанные способы обладают такими недостатками, как низкая эффективность посева и неравномерное распределение клеток в объеме матрицы. Также стоит отметить, что все известные исследования были выполнены строго для определенной модели матрицы и поэтому не могут быть экстраполированы на другие.

Техническим результатом изобретения является создание способа, обеспечивающего равномерное распределение клеток в объеме матрицы из микроволокон поли(L-лактида).

Заявленный технический результат обеспечивается выполнением способа создания тканеинженерного сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида), включающего посев клеточного материала на матрицу, согласно которому, культуральную среду, содержащую 2×10⁶ клеток на 10 мм длины матрицы, фильтруют, вводя ее в просвет матрицы, а отфильтрованную культуральную среду собирают и процедуру ее введения повторяют, по меньшей мере, дважды, далее матрицу с нанесенными клетками инкубируют в СО₂-инкубаторе в течение 1 часа.

Для разработки способа было проведено исследование, включавшее ряд этапов.

1. Изготовление матрицы.

Трубчатые матрицы на основе микроволокон поли(L-лактида) (ПЛА) M_w=50 кДа получали методом электроформования из раствора ПЛА в хлороформе на лабораторной установке Nanon-01A (Япония). Раствор ПЛА концентрацией 15 wt % с помощью инжекторного насоса подавали через электрод-фильеру в электрическое поле (V=16 kV) при расстоянии между электродами 0,15 м, осаждение волокон происходило на цилиндрическом электроде диаметром 1,1 мм. Скорость вращения последнего составляла 1500 об/мин. Получены трубчатые матрицы с внутренним диаметром 1,1 мм и толщиной стенки 320 мкм. По данным сканирующей электронной микроскопии на аппарате Supra 55VP (Carl Zeiss) в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 5 кВ выявлено, что микроволокна в структуре матрицы имеют хаотичное расположение, размеры пор между ними 75±14 мкм, что сопоставимо с размерами как мезенхимных стволовых клеток жировой ткани (МСК ЖТ), так и других соматических клеток.

2. Получение культуры мезенхимных стволовых клеток жировой ткани

Для получения первичной культуры МСК ЖТ использовали известную методику селекции по адгезии к пластику [Zhu М, Heydarkhan-Hagvall S, Hedrick М, Benhaim Р, Zuk P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. 2013; 79. doi: 10.3791/50585]. Для выделения клеток был использован биологический материал одной взрослой лабораторной крысы линии Вистар (масса - 255 г, самец). Полученную жировую ткань в чашке Петри механически гомогенезировали. Затем проводили энзиматическую диссоциацию клеток 0,2% раствором коллагеназы I (Gibco, США) в растворе Хенкса в термошейкере (Biosan ES-20) в течение 60 мин при 37°С. После нейтрализации действия коллагеназы добавлением 10% фетальной сыворотки крови телят (Gibco, США) суспензию центрифугировали 10 мин при 1,5 тыс.об/мин. Полученный осадок ресуспендировали полной питательной средой α-МЕМ («Панэко», Россия) с добавлением L-глютамина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки и антибиотиков 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы Gibco, США) и культивировали в условиях СО₂-инкубатора (Thermo Fisher Scientific, 3423) при температуре 37°С, концентрации СO₂ 5% и повышенной влажности. Через 48 ч неприкрепленные клетки, форменные элементы крови и соединительнотканную строму удаляли двукратной отмывкой фосфатно-солевым буфером (ФСБ). На 5 сутки клетки иммобилизовали 0,05% раствором трипсина (Gibco, США) и проводили пересев (1 пассаж). В дальнейшем культивирование МСК ЖТ проводили в культуральных флаконах площадью 175 см² (Eppendorf) до достижения субконфлюентности монослоя (70% площади поверхности). Для культивирования использовали клетки 3-8 пассажей.

3. Посев МСК ЖТ на ПЛА матрицу

Посев МСК на матрицу выполняли статичным, вакуумным или разработанным фильтрационным методами. Последующее культивирование в СO₂-инкубаторе проводили в пробирках-биореакторах в 10 мл питательной среды (здесь и далее α-МЕМ «Панэко», Россия) в течение 1, 3 и 7 сут. Оценку распространения клеток в объеме ПЛА матрицы выполняли с использованием флуоресцентной микроскопии (Zeiss LSM 5 PASCAL) с визуализацией ядер клеток при помощи красителя DAPI в концентрации 1 мкг/мл.

Статичный посев проводили путем нанесения суспензии клеток 2×10⁶ МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды на образец матрицы длиной 10 мм, при этом половину суспензии вводили в просвет графта, а вторую половину равномерно распределяли по наружной поверхности. Далее матрицу помещали в СО₂-инкубатор на 1 ч, при этом каждые 15 мин выполняли ее поворот на 90 градусов вдоль продольной оси и дополнительное орошение питательной средой.

Через 1 сут. большая часть клеток располагалась отдельными локусами без существенного проникновения вглубь стенки графта. С увеличением времени распространения клеток в объеме матрицы не происходило. Через 7 суток культивирования внутренняя и, в большей степени, наружная поверхности графта были неравномерно покрыты МСК без проникновения вглубь стенки матрицы. Таким образом, статичный метод посева не обеспечивает равномерного распределения клеток в объеме матрицы.

Вакуумный посев МСК ЖТ выполняли по известной методике [Tan L., Ren Y., Kuijer R. 2012. A 1-min method for homogenous cell seeding in porous scaffolds. J. Biomat. Appl. 26: 877-889.] с определенными модификациями. В шприц объемом 3 мл помещали матрицу длиною 10 мм и клеточную суспензию 2×10⁶ МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды. Кроме того, в шприц забирали дополнительный объем воздуха (0.1 мл) и закрывали трехходовым краном. После этого производили оттягивание поршня шприца до отметки 3 мл с его удержанием в течение 10 с. Далее поршень возвращали в изначальное положение на 10 с. Процедуру повторяли десять раз. Шприц закрывали антибактериальным фильтром с размерами пор 0.22 мкм (Orange Scientific, Бельгия) и помещали в СО₂-инкубатор на 1 ч.

При вакуумном посеве МСК ЖТ распределились в основном на внешней поверхности матрицы отдельными кластерами без значимого проникновения внутрь. Через 3 суток культивирования происходило постепенное распространение клеток по внешней поверхности графта с незначительной инвазией вглубь. Значимого улучшения распределения клеток в сторону равномерности и проникновения в объем матрицы через 7 сут не наблюдалось.

Фильтрационный посев производили путем временного пережатия одного конца матрицы длиной 10 мм пинцетом, а через второй ее конец, используя венозный катетер, подсоединенный к инсулиновому шприцу, вводили клеточную суспензию 2×10⁶ МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды. Отфильтрованную среду собирали в пробирку и процедуру ее введения повторяли дважды. Таким образом, стенка матрицы играла роль фильтра. При этом наружный диаметр венозного катетера точно совпадал с внутренним диаметром матрицы. При таком посеве стенка матрицы играет роль своеобразного фильтра для клеток. Через 1 сут. регистрировали формирование градиента плотности клеток от максимальной на внутренней поверхности до минимальной на внешней поверхности графта. Постепенно, через 3 сут., снижалась разница распределения клеток по плотности в толще матрицы, а через 7 сут. сформированный вначале градиент плотности практически нивелируется за счет увеличения количества клеток на периферии стенки матрицы. Исследование показало, что фильтрационный посев обеспечивает равномерное распределение МСК ЖТ в объеме матрицы.

Для разработанного фильтрационного посева МСК ЖТ на ПЛА матрицу было выполнено определение времени адгезии МСК ЖТ к ПЛА матрице и изучение оптимального числа клеток для посева на 10 мм ее длины.

Для определения времени, необходимого МСК ЖТ для прикрепления к исследуемой ПЛА матрице при выполнении фильтрационного посева, поставлена серия экспериментов. В ходе экспериментов производили фильтрационный посев фиксированного числа МСК ЖТ (2×10⁶ МСК ЖТ в 50 мкл питательной среды) на ПЛА матрицы длиной 10 мм. Далее матрицы с МСК ЖТ помещали в СО₂-инкубатор на 1, 2 или 3 ч. Затем трехкратно промывали просвет матриц раствором ФСБ, окрашивали МСК ЖТ в промывочной среде 0.4% трипановым синим (Invitrogen, США) и считали их с помощью автоматического счетчика клеток Countess II (Invitrogen, США). Подсчет МСК ЖТ в промывочном растворе показал, что большая часть клеток прикрепляется к матрице в течение первого часа: число МСК ЖТ × 10³ в промывочном растворе через 1 час - 314±3; 2 часа - 356±4; 3 часа - 348±3). При увеличении времени культивирования не происходит значимого нарастания числа прикрепившихся клеток

С целью определения оптимального числа МСК ЖТ для фильтрационного посева на ПЛА матрицу длиной 10 мм использовали следующие количества клеток (×10⁶): 0.5, 1.5, 2, 3 и 4 с последующей инкубацией в пробирке-биореакторе с питательной средой объемом 10 мл в течение 1 ч. Затем матрицы трехкратно промывали раствором ФСБ, и считали клетки как в исходной среде, так и в промывочной. Число прикрепившихся МСК ЖТ рассчитывали вычитанием из общего числа посеянных клеток числа нефиксированных МСК в исходной среде и их числа в промывочной среде. Эффективность посева определяли как отношение числа адгезировавших клеток к их исходному числу, выраженное в процентах. Было установлено, что при повышении концентрации МСК ЖТ в питательной среде при посеве происходит линейный рост числа прикрепившихся к матрице клеток, но только до определенного уровня. При исходном числе клеток более 2×10⁶ значимого увеличения числа прикрепившихся клеток не происходит. Таким образом, оптимальным числом МСК ЖТ в клеточной суспензии, используемой для фильтрационного посева клеток, является 2×10⁶ на 10 мм длины матрицы. Эффективность посева при этом составляет 63%.

Таким образом, доказано, что интеграция клеток с ПЛА матрицей путем фильтрационного посева, в ходе которого стенка матрицы выступает в роли своеобразного фильтра, является оптимальным технологическим решением. Показано, что при таком способе посева большая часть МСК ЖТ прикрепляется к ПЛА матрице в течение первого часа. Оптимальное количество клеток, необходимое для засевания матрицы составляет 2×10⁶ на 1 см ее длины.

Использование заявленного способа обеспечивает равномерное распределение клеток в объеме сосудистого имплантата на основе трубчатой биоразлагаемой полимерной матрицы из микроволокон поли(L-лактида).