Способ интраоперационной визуализации ишемически-реперфузионного повреждения миокарда

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиохирургии, и может быть использовано для мониторинга состояния миокарда при оперативных вмешательствах на открытом сердце.

Интраоперационный мониторинг проявлений обратимого и необратимого ишемического-реперфузионного повреждения (ИРП) миокарда при операциях на сердце важен, как в условиях экстракорпорального кровообращения и кардиоплегии, так и на работающем сердце (off pump), для оптимизации тактики оперативного вмешательства и кардиоанестезиологической поддержки.

Известен способ интраоперационной визуализаци ишемии миокарда, основанный на регистрации автофлуоресценции миокарда (Mayevsky A, Rogatsky G.G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell 292: C. 615-640, 2007). Он базируется на изменении внутриклеточного редокс-состояния дыхательного кофермента пиридин нуклеотида (НАД), который в клетке может существовать в окисленной (НАД+) и восстановленной (НАДН) формах. При ишемии из-за нарушения окисления через цепь митохондриального транспорта электронов имеющийся в норме баланс между ними нарушается в пользу восстановленной формы. Благодаря тому, что восстановленная форма при возбуждении ультрафиолетовыми лучами (320-380 нм) обладает интенсивной флуоресценцией в сине-зеленой области спектра (420-480 нм), появляется возможность обнаруживать ткань, находящуюся в условиях ишемии. Реализация способа заключается в освещении поверхности сердца возбуждающим излучением от осветителя, который генерирует излучение в ближней ультрафиолетовой области 320-380 нм, построении изображения объекта в свете автофлуоресценции в области 420-480 нм, его телевизионной регистрации и оценке автофлуоресцентной картины, доступной обзору поверхности сердца. Способ является наиболее близким к заявляемому изобретению.

Известный способ имеет ряд недостатков. Во-первых, автофлуоресцентная визуализация направлена на выявление ранних, обратимых проявлений ишемического повреждения, и не позволяет выявлять в пределах зоны ишемии участки необратимого повреждения миокарда. Это объясняется тем, что большая часть миокарда, находящегося в состоянии необратимого ИРП, погибает посредством некроза, при этом восстановленная форма НАДН разрушается под действием активирующихся ферментов (гликогидролаз) (Vivaldi МТ, Kloner RA, Schoen FJ. Triphenyltetrazolium staining of irreversible ischemic injury following coronary artery occlusion in rats. Am J Pathol. 1985 Dec; 121(3): 522-30). Во-вторых, такая визуализация требует затемнения операционной комнаты, чтобы избежать влияния внешней засветки на сигнал автофлуоресценции.

Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в выявлении в пределах зоны ишемии участков необратимого повреждения миокарда, возможности проведения исследований в условиях незатемненной операционной комнаты, а также количественной оценке ишемического повреждения миокарда.

Указанный технический результат достигается в способе интраоперационной визуализации ишемически-реперфузионного повреждения миокарда, включающем освещение поверхности сердца возбуждающим излучением, регистрацию изображения в свете флуоресценции и анализ изображения, в котором пациенту внутривенно вводят индоцианин зеленый (ИЦЗ) и через 10-30 минут после введения регистрируют флуоресцентное изображение при излучении возбуждения 780-810 нм и излучении регистрации 820-900 нм.

Оказалось целесообразным введение ИЦЗ, предварительно связанного с белками.

Наилучший результат достигается при использовании в качестве белка альбумина.

Для количественной оценки ишемического повреждения миокарда производят измерение сигналов флуоресценции в участках изображения миокарда с ишемическим повреждением и без него и вычисляют индекс ишемически-реперфузионного повреждения по формуле

ИИРП=F_и/F_н,

где F_и - сигнал с участка миокарда с ишемическим повреждением, F_н - сигнал с участка миокарда без ишемического повреждения.

Заявленный способ основан на экспериментально обнаруженном авторами явлении накопления ИЦЗ в зоне необратимого ИРП миокарда. Механизм визуализации ИРП с помощью ИЦЗ заключается в возникновении контраста свечения ИЦЗ между зоной ИРП и окружающей непораженной зоной, который возникает следующим образом. После внутривенного введения ИЦЗ сразу начинает связывается с плазматическими белками, включая альбумин, и в связанном виде захватывается печенью. Через час ИЦЗ полностью выводится печенью и почками из кровотока в две фазы. В первую, быструю фазу (20 минут), органы выведения способны быстро, за 5-10 минут, понизить концентрацию ИЦЗ в крови, а через 20 минут в плазме остается до 4% от исходной концентрации. Визуализация зон ИРП миокарда связана, по-видимому, с нарушением проницаемости сосудов в патологической зоне, где он надолго задерживается из-за малой скорости вывода из организма интерстициальной (межклеточной) жидкости. Если пациенту с ИРП (острый коронарный синдром, инфаркт миокарда), которому восстановили кровоток по инфаркт-зависимой коронарной артерии (тромболизис или операции реваскуляризации), ввести ИЦЗ, то через 20 минут после первой фазы выведения ИЦЗ из кровотока область ИРП начинает светиться, а флуоресценция в непораженной зоне, наоборот, падает, создавая в области ИРП положительный контраст. Поэтому не ранее чем через 10 минут можно увидеть этот контраст флуоресцентного свечения ИЦЗ, который хорошо виден на 20-й минуте и достигает максимума к 30-й минуте.

Индоцианин зеленый (кардиогрин) применяется в медицине для решения различных задач. Он используется как абсорбционный краситель, позволяющий проводить прижизненные исследования, и как флуоресцирующее вещество, излучающее в инфракрасной (ИК) области спектра. ИК-флуоресценция ИЦЗ широко применяется в офтальмологии для визуализации состояния сосудов глазного дна (Пасечникова Н.В., Гут Ю., Гут И. Основные принципы и клиническое использование индоцианин зеленой ангиографии в диагностике патологии глазного дна. Офтальмологический журнал №2. 2008. С. 63-67). Визуализация в свете ИЦЗ флуоресценции применяется также в общей хирургии для обнаружения опухолей, определения сторожевых лимфоузлов, лимфографии, визуализации желчных протоков (Alander J.Т. et al. A Review of Indocyanine Green Fluorescent Imaging in Surgery. International Journal of Biomedical Imaging Volume 2012, Article ID 940585, 26 pages doi:10.1155/2012/940585). В кардиохирургии ИЦЗ применятся во время операции с целью ангиографии для проверки наличия препятствия кровотоку (Yamamoto М. et al. Assessing intraoperative blood flow in cardiovascular surgery. Surg Today. 2011 Nov; 41 (11): 1467-74).

Однако сведений об использовании ИЦЗ для выявления необратимого ИРП в доступных источниках информации авторами не обнаружено.

Визуализация зоны ишемического повреждения в свете ближней ИК-флуоресценции с использованием флуоресцентного красителя, препарата ИЦЗ, обеспечивает возможность проведения исследований в условиях незатемненной операционной комнаты.

Предварительное связывание ИЦЗ с белками повышает избирательность накопления флуорофора в зоне необратимого повреждения миокарда.

Связывание ИЦЗ с белком альбумином позволяет получать наиболее контрастную картину флуоресценции зоны ИРП.

Определение индекса ишемического-реперфузионного повреждения (ИИРП) по формуле ННРП=F_и/F_н повышает удобство и достоверность оценки ИРП миокарда.

Изобретение поясняется чертежами, где представлены:

на фиг. 1 - блок-схема устройства для флуоресцентной визуализации в ближней ИК-области спектра, на котором проводились исследования;

на фиг. 2 - фотографии сердца крысы в обычном свете - левая колонка, и в свете ИК-флуоресценции - правая колонка; А, Б - фотографии работающего сердца в момент начала внутривенного введения раствора ИЦЗ; В, Г - фотографии работающего сердца через 20 минут после восстановления кровотока; Д, Е - фотографии поверхности извлеченного сердца крысы через 30 минут после окончания ишемии; Ж, З - фотографии зоны ИРП на срезе сердца: Ж - после гистохимической окраски среза с 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом (ТТС), З - вид того же среза в свете ИК-флуоресценции.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Во время выполнения операции на сердце в условиях экстракорпорального кровообращения за 10-30 минут перед проведением исследования внутривенно вводят раствор ИЦЗ (0,2-2 мг/мл) в объеме 2-5 мл (0,2-0,5 мг/кг). Возможно также применение смеси ИЦЗ с альбумином. При использовании в качестве растворителя 20% альбумина человека оптимальной концентрацией является 2,5 мг/мл. Затем проводят телевизионную регистрацию в свете ИК-флуоресценции при возбуждении излучением в области 780-810 нм и регистрации в области 820-900 нм. Для регистрации может быть использована, например, цифровая телевизионная камера, разработанная в Российском научном центре в Сеуле (Kang Uk, Papayan G.V. Fluorescent endoscope system having improved image detection module. US Patent No US 7635330. 22.12.2009). Она обеспечивает возможность телевизионной визуализации и измерения с помощью компьютера яркости отдельных структур объекта одновременно в видимой области и ближней ИКобласти спектра в диапазоне 820-900 нм. В построенный на ее основе комплекс (Фиг. 1), кроме телевизионной камеры 1, входит также полупроводниковый лазер 2 с длиной волны 808 нм. Он обеспечивает возбуждение ИК-флуоресценции. Лазерное излучение направляется на поверхность миокарда 3 через волоконный световод 4. Захват и анализ изображения производится с помощью компьютера 5, оснащенного специальной программой, позволяющей отображать на экране монитора один и тот же объект в двух смежных кадрах - черно-белом и цветном. В черно-белом кадре изображение объекта формируется в свете ИК-флуоресценции за счет использования лазерного освещения, в цветном кадре оно представляется в обычном виде за счет его освещения операционной лампой. Обычное изображение используют для анатомической идентификации областей повышенной ИК- флуоресценции. С помощью программы в интерактивном режиме производят измерение сигналов в участках изображения миокарда с ишемически-реперфузионным повреждением, и без повреждения, и по ним определяют индекс ишемически-реперфузионного повреждения.

Способ иллюстрируется примером проведенных экспериментальных исследований на in-vivo модели ишемии-реперфузии миокарда крысы. Суть модели локального ишемически-реперфузионного повреждения миокарда крысы заключается в выполнении на наркотизированной крысе торакотомии и 30-минутной перевязки лигатурой передней нисходящей ветви левой коронарной артерии.

В условиях искусственной вентиляции легких через трахеостому (частота дыхания

- 60/мин, дыхательный объем - 3 мл/100 г массы тела) и поддержания постоянной температуры тела (37,0±0,5°С), при помощи термостатируемого операционного стола выполнена левосторонняя торакотомия в четвертом межреберье. С помощью атравматической иглы подведена полипропиленовая лигатура (6-0) под левую коронарную артерию (ЛКА) между анатомическими ориентирами, которыми являлись медиальный край ушка левого предсердия слева и конус легочной артерии справа. Обратимую 30-минутную ишемию миокарда формировали с помощью окклюдера [Himori N, Matsuura А. A simple technique for occlusion and reperfusion of coronary artery in conscious rats. Am J Physiol. 1989 Jun; 256(6 Pt 2): Н1719-25]. Через 25 минут ишемии проводили 10-минутную инфузию раствора ИЦЗ в объеме 1 мл (0,25 мг/мл ИЦЗ) или ИЦЗ + альбумин в объеме 1 мл (0,25 мг/мл ИЦЗ + альбумин 20% 0,1 мл), то есть введение начинали за 5 минут до окончания ишемии. Телевизионное наблюдение и видеозапись состояния миокарда in-vivo осуществляли с помощью устройства, представленного на фиг. 1.

Затем сердце иссекали, проводили фотографирование миокарда со стороны наружной поверхности сердца и в срезе с последующим измерением интенсивности свечения ИЦЗ в зоне ишемически-реперфузионного повреждения и в окружающей неповрежденной ткани с расчетом ИИРП.

Фотографии работающего сердца (фиг. 2А, Б, В, Г) получены интраоперационно (in vivo), через раневое окно в четвертом межреберье во время формирования локального ишемически-реперфузионного повреждения миокарда крысы. Post-mortem изображения извлеченного сердца крысы (фиг. 2Д, Е, Ж, З) получены через 30 минут после окончания ишемии.

На фиг 2А, Б изображен момент начала внутривенного введения раствора ИЦЗ, когда еще на левой коронарной артерии был наложен окклюдер, создающей ишемию миокарда. Окклюдер препятствовал прохождению флуорофора только в ишимизированный миокард, что подтверждается дефектом наполнения флуоресцентного красителя и отсутствием флуоресцентного свечения ИЦЗ в зоне ишемии, при этом наблюдалось свечение (фиг. 2Б) в остальном миокарде, в котором кровоток был сохранен и куда поступал флуоресцентный краситель. ИЦЗ вводили непрерывно 10 минут, при этом окклюдер был удален на 5-й минуте его внутривенного введения и флуорофор с кровотоком прошел по инфаркт-зависимой коронарной артерии и прокрасил ишемизированную зону, которая до этого не светилась, поэтому оставшиеся 5 минут внутривенного введения ИЦЗ флуоресцентное свечение наблюдалось на всей поверхности сердца.

Через 20 минут после восстановления кровотока видно сохраняющееся интенсивное свечение зоны ИРП (фиг. 2В, Г), где произошло накопление ИЦЗ, при низкой интенсивности флуоресцентного свечения окружающих тканей.

На фиг. 2Е видно флуоресцентное свечение эпикарда в зоне ИРП миокарда, при этом в режиме обычной съемки данное свечение не фиксируется (фиг. 2Д).

Срез сердца подвергали гистохимической окраске с 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом (ТТС). Зоне ИРП на фиг. 2Ж соответствует белая, неокрашенная в красно-кирпичный цвет, ткань миокарда, а на фиг. 2З - зона свечения накопившегося за время реперфузии ИЦЗ. Контуры и размер неокрашенной зоны ИРП на фиг. 2Ж соответствуют контурам и размерам зоны свечения на фиг. 2З, что свидетельствует о накоплении ИЦЗ в зоне необратимо поврежденного миокарда. Максимальное значения ИИРП в этой зоне составляло 6,3.

Использование заявленного способа позволяет выявлять в пределах зоны ишемии участки необратимого повреждения миокарда, количественно оценивать ишемическое повреждение миокарда, при этом не требует при проведении исследования затемнения операционной комнаты.