СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОГО БИОДЕГРАДИРУЕМОГО ПОРИСТОГО КОМПОЗИЦИОННОГО МАТЕРИАЛА

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к биосовместимым биодеградируемым пористым композиционным материалам на основе хитозана и нанофибрилл хитина, и технологии их получения.

Изобретение может найти применение в медицине, ветеринарии, фармакологии, биотехнологии. Заявляемые биосовместимые

биодеградируемые пористые композиционные материалы предназначены для использования в качестве раневых покрытий, гемостатических, тампонирующих материалов, объемозамещающих медицинских материалов (для замещения недостатка тканей после хирургического удаления), матриц для адгезии, пролиферации и дифференциации клеток в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии.

В современной медицине и трансплантологии чрезвычайно актуальны биосовместимые биодеградируемые пористые материалы. Для этих материалов особый интерес представляют хитин и хитозан, полимеры, получаемые из природного сырья, входящего в состав панцирей ракообразных.

Пористые материалы, которые могут быть использованы в медицине, тканевой инженерии, клеточных технологиях, должны обладать комплексом свойств: отсутствием цитотоксичности, высокой паро- и газопроницаемостью. Размер пор должен обеспечить адгезию и распластывание клеток на их поверхности. Для пролиферации клеток в объеме матрицы поры должны иметь форму сообщающихся каналов, по которым возможно движение клеток. Пористые материалы, используемые в качестве раневых покрытий, должны препятствовать проникновению патогенной среды на раневую поверхность и способствовать ускорению заживления раны.

Известно несколько способов создания пористых полимерных структур. Например, в расплав или раствор полимера вводят порообразователь (аэросил). Также возможно формование пористого материала из раствора в жесткую осадительную ванну, при этом осадитель интенсивно замещает растворитель (Патент RU 2504561, 2014). Для получения пористой структуры полимерные пленки бомбардируют α-частицами с последующим травлением их в щелочи. Во всех этих известных способах используют химические реагенты, остатки которых могут длительное время сохраняться в пористом материале. Наличие инородных химических веществ, в случае использования пористого материала в биотехнологиях, вызывает его цитотоксичность. Устранение этого недостатка является важной технологической проблемой.

Известен способ получения раневого покрытия на основе хитозана [EP 1401352 B1, 2012], в котором материал обладает гемостатическими свойствами. Раствор хитозана лиофилизируют, после чего блочный образец с размером пор около 50 мкм выдерживают при температуре 80°C, затем подвергают прессованию при давлении 50 кПа. Полученный образец имеет толщину 5,5 мм, обладает адгезионной прочностью по отношению к раневой поверхности не менее 60 кПа.

Губки из хитозана медицинского применения получали методом пропускания воздуха или углекислого газа через раствор хитозана с последующей дегидратацией, а также методом его заморозки и последующей сушки под вакуумом [US 2011/0274726 A1, 2011]. Полученные пористые губки подвергали прессованию до получения материала толщиной 1,2 мм, после стерилизации материал использовали в качестве раневого покрытия.

Однако в приведенных способах получения материалов на основе хитозана не решается проблема стабилизации пористой структуры в сухом и особенно во влажном состоянии, что неблагоприятно сказывается на возможности применения таких материалов в медицинской практике.

Анализ приведенных выше аналогов свидетельствует о том, что получение композиционного пористого материала со стабильной структурой в активных биологических средах и одновременно характеризуемого резорбцией как полимерной матрицы, так и наполнителя, является актуальной задачей получения материалов медицинского назначения, а также матриц для клеточных технологий.

Наиболее близкими к заявляемому изобретению является композиционный биосовместимый, биодеградируемый пористый материал на основе хитозана [RU 2471824, C08J 9/00, А61К 33/00, 2014].

Композиционный материал-губка состоит из хитозановой матрицы и неорганического наполнителя. Используют наполнитель из ряда: монтмориллонит, галлуазит, бентонит, гидроксиапатит, которые повышают стабильность упругих свойств и пористой структуры в жидких средах, что положительно сказывается на процессах адгезии объемной пролиферации стволовых и соматических клеток in vivo.

Однако указанные наполнители не являются биодеградируемыми и не подвержены биорезорбции при контакте с активной биологической средой живого организма, включающей ферменты, макрофаги и др. Поэтому композиционный материал, содержащий такие наночастицы нельзя рассматривать как полностью биодеградируемый. Механизм взаимодействия стволовых и соматических клеток организма с небиодеградируемыми наночастицами различного химического строения, формы и размеров не достаточно изучен. Существуют данные о токсическом воздействии небиодеградируемымых наночастиц на клетки живого организма, в различных органах и системах [Assessing Nanoparticle Toxicity / Sara A. Love et al. // Annu. Rev. Anal. Chem. - 2012. - N 5. - P. 181-205. Review. Nanoparticles toxicity and their routes of exposures / Clarence Suh Yah et al. // Рак. J. Pharm. Sci. - 2012. - Vol. 25. - N 2. - P. 477-491]. Подобное воздействие может привести к возникновению заболеваний дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта, нервной системы, повреждению органов зрения и слуха и др. [Review. Nanoparticles toxicity and their routes of exposures / Clarence Suh Yah et al. // Pak. J. Pharm. Sci. - 2012. - Vol.25. - N 2. - P. 477-491. A review of nanoparticle functionality and toxici central nervous system / Z. Yang et al. // J. R. Soc. Interface. - 2010. - N 7. - P. 411-422].

Известный материал не порочит новизну заявляемого изобретения, т.к. он не является полностью биодеградируемым, поэтому не может безопасно быть использован в качестве раневых покрытий, а также других материалов медицинского и биологического назначения.

Технической задачей и положительным результатом предлагаемого изобретения является создание биосовместимого биодеградируемого пористого материала на основе хитозана с системой открытых пор со стабильной пористой структурой в водных средах для использования в медицине, ветеринарии, биотехнологии, например в качестве раневых покрытий и гемостатических губок. Создаваемый материал не должен содержать следов химических веществ, потенциально обладающих токсичностью и небиодеградирующих добавок, способных вызвать повреждение органов и тканей. Материал должен обладать сквозной пористой структурой, сохранять свою форму и размеры в жидких биологических средах. Механические характеристики материала должны позволять манипуляции с ним как в сухом, так и во влажном состоянии. Материал или фрагменты материала должны подвергаться полной биорезорбции в организме реципиента в течение нескольких недель, при этом не должно наблюдаться воспалительной реакции на материал и его отторжение. Продукты резорбции материала должны быть биосовместимы и биорезорбируемы, не должны обладать токсичностью.

Указанная задача и технический результат достигаются в способе получения биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала за счет того, что он включает смешивание предварительно диспергированных в водной среде с рН=5-7 в ультразвуковом поле с частотой v=20-100 кГц в течение 5-60 мин нанофибрилл хитина с хитозаном со степенью деацетилирования 60-95%, молекулярной массой 50-450 кДа, в количестве, соответствующем его концентрации в растворе 0,1-10 мас. %, при этом количество наполнителя составляет 0,1-50% от массы хитозана, интенсивно перемешивают полученную смесь при температуре 20-50°C в течение 20-60 мин, добавляют концентрированную кислоту в количестве, соответствующем получению в смеси водного раствора кислоты концентрацией 0,1-5%, интенсивно перемешивают смесь при температуре 20-50°C в течение 20-250 мин, добавляют лекарственные средства, пластификаторы, биорезорбируемые полимеры, перемешивают смесь при температуре 20-50°C в течение 20-60 мин, охлаждают ее до температуры -0,1- -196°C, удаляют растворитель в вакууме, обрабатывают полученный целевой материал нейтрализующим реагентом, промывают водой до рН=6-7 и высушивают или подвергают термообработке при температуре 50-200°C в течение 10-360 мин, и получают пористый материал с системой сквозных пор размером 1-1000 мкм, пропитывают материал лекарственными средствами, пластификаторами, биорезорбируемыми полимерами.

В состав материала непосредственно и/или в виде пропитки дополнительно входят антикоагулянты, антибиотики, антисептики, противовоспалительные средства, антиоксиданты, витамины, сорбенты, препараты, отдельно или вместе стимулирующие заживление раны и рост клеток, в количестве 0,0001-10% от массы хитозана.

Также в состав материала непосредственно и/или в виде пропитки дополнительно входит пластификатор из ряда: глицерин, сорбит, манит, пропиленгликоль и другие многоатомные спирты или их смеси произвольного состава, в количестве 0,1-100% от массы хитозана.

Он также дополнительно содержат 0,1-50 мас.% биорезорбируемых полимеров из ряда: поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, водорастворимые производные целлюлозы, хитин, альгинат, желатин, крахмал, декстран, полигиалуроновую кислоту, полипептиды, их сополимеры или смеси произвольного состава.

В качестве растворителя используют кислоты: уксусную, янтарную, угольную, муравьиную, серную, соляную, бензойную, сорбиновую, молочную кислоту и/или их смеси произвольного состава.

В качестве нейтрализующего реагента берут спирты, растворы аммиака или щелочи.

Материал также подвергается термической обработке при температуре 50-200°C в течение 10-360 мин.

Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала.

Только совокупность существенных признаков заявляемого биосовместимого биодеградируемого пористого композиционного материала позволяет достичь указанного технического результата. Совершенно неожиданным явился факт, что на основе хитозана и нанофибрилл хитина удастся получить биосовместимый биодеградируемый пористый материал со стабильной и высокопроницаемой пористой структурой в водных средах, к тому же полностью биорезорбируемый и не обладающий цитотоксичностью. Применение нанофибрилл хитина само по себе не гарантировало получение стабильной и высокопроницаемой пористой структуры. Только оригинальная совокупность условий способа привела к целевому результату.

В таблице 1 приведены значения динамического модуля упругости композиционных губок, полученных из 4% раствора хитозана, содержащих различное количество нанфибрилл хитина. Использован хитозан производства фирмы Sigma-Aldrich (США) из панцирей крабов, степень деацетилирования 85%, молекулярная масса 250 кДа, нанофибриллы хитина производства фирмы Mavi Sud S.r.1, (Италия), степень деацетилирования 12%, средний размер частиц составляет: длина ~500 нм, диаметр ~20 нм. Измерен динамический модуль упругости на сжатие образцов губок в сухом состоянии и в воде на установке DMA 242 С фирмы NETZSCH на частоте 1 Гц при температуре 20°C.

Из приведенных данных следует, что введение нанофибрилл хитина повышает модуль упругости губки в сухом состоянии и в водной среде, что свидетельствует о стабилизации структуры губок при введении нанофибрилл хитина.

Приведены фотографии губок из хитозана (образец слева) и композиционных губок, содержащих 3 мас. % нанофибрилл хитина в исходном воздушно-сухом состоянии (фиг. 1), после выдержки в воде в течение 1 часа (фиг. 2) и после повторной сушки (фиг. 3).

Видно, что добавление к хитозану нанофибрилл хитина приведет не только к эффекту сохранения формы и размеров губки во влажном состоянии, но и к сохранению открытости пор, проницаемости губки и стабильности пористой системы (фиг. 4).

Высокая эластичность и достаточная прочность (как в сухом, так и в мокром состояниях позволяет предлагаемый материал использовать в виде раневых покрытий (фиг. 5) и гемостатических назальных тампонов (фиг. 6), хорошо повторяющий сложный рельеф раневой поверхности.

Исследование цитотоксического действия композитного материала на мезенхимные стволовые клетки крысы (ASCs) показало, что в клетках, культивированных в течение 6 суток на пористых материалах, содержащих 3 мас. % нанофибрилл хитина, не выявлено стабилизации в ядре фокусов гамма-Н2АХ гистона. Стабилизация в ядре гамма-Н2АХ гистона является показателем цитотоксического воздействия, ведущего к стандартному ответу клетки на повреждения. Таким образом, можно заключить, что введение нанофибрилл хитина не оказывает острого токсического воздействия на клетки.

Скорость и механизм биорезорбции материалов изучался на живых объектах. Самки крыс весом 350 г, одной генетической линии, оперированы под ингаляционной анестезией, фрагменты композитного материала помещались между мышечных волокон длинной мышцы спины крысы, после этого рана послойно ушивалась. В послеоперационном периоде производилось наблюдение за цветом и температурой кожных покровов и двигательной активностью животных. После извлечения, материал исследовался стандартными гистологическими методами.

Через 1 неделю экспозиции в мышечной ткани подопытного животного композитный материал на основе хитозана, содержащий 3 мас. % нанофибрилл хитина, полностью пропитывается иммунными клетками (фиг. 7), при этом признаков воспаления не выявлено, также не наблюдалось признаков гибели иммунных клеток, что свидетельствует об отсутствии токсического воздействия материала на окружающие клетки и ткани. Наблюдаются начальные признаки биорезорбции материала.

Через 2 недели экспозиции материала наблюдаются отчетливые признаки резорбции, с замещением материала соединительной тканью, токсического воздействия также не обнаружено (фиг. 8).

Через 6 недели экспозиции наблюдаются полная биорезорбция композитного материала с замещением его нормальной соединительной тканью (фиг. 9).

Описываемый способ поясняется далее на примерах его осуществления.

Пример №1. Биосовместимый биодеградируемый пористый композиционный материал, включающий хитозан и нанофибриллы хитина в диспергированном состоянии в количестве 3% от массы хитозана, с системой сквозных пор диаметром 1-1000 мкм. Получение материала. Диспергируют 1,2 г нанофибрилл хитина в 1000 мл воды, pH=7, в ультразвуковом поле с частотой v=20 кГц в течение 15 мин с получением дисперсии нанофибрилл хитина. Смешивают диспергированные в водной среде нанофибриллы хитина и хитозан со степенью деацетилирования 85%, молекулярной массой 250 кДа в количестве 40 г, соответствующем концентрации раствора 4 мас. %, при этом количество нанофибрилл хитина составляет 3% от массы хитозана, добавляют концентрированную уксусную кислоту в количестве 20 мл, соответствующем получению в смеси водного раствора уксусной кислоты концентрацией 2%, полученную смесь перемешивают со скоростью 1200 об/мин при температуре 20°C в течение 20 мин. Добавляют 0,1 г антибиотика (ампициллина), что составляет 0,25% от массы хитозана, добавляют 0,1 г пластификатора (глицерина), что составляет 0,25% от массы хитозана, добавляют 1 г биорезорбируемого полимера (полигиалуроновую кислоту), что составляет 2,5% от массы хитозана. Интенсивно перемешивают смесь при температуре 20°C в течение 30 мин, охлаждают ее до температуры -4°C. Удаляют растворитель в вакууме. Обрабатывают полученный пористый материал 5% водным раствором NaOH, промывают водой до pH=7 и высушивают целевой материал. Затем материал подвергается термической обработке при температуре 100°C в течение 30 мин. Материал пропитывают 0,01% раствором антисептика (фурацилина), 1% раствором пластификатора (глицерина), 10% раствором биорезорбируемого полимера (желатина).

Диаметр пор 1-1000 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии E=6.5 МПа, во влажном - E=0.06 МПа. Электронно-микроскопический снимок скола губки показал, что наполнитель находится в диспергированном состоянии, поры имеют форму сквозных каналов (фиг. 4). После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры (фиг. 2), после сушки форма и размеры также не изменились (фиг. 3).

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 6 недель экспозиции в подопытном животном (фиг. 9).

Пример №2. В условиях примера №1, при получении материала используется хитозан со степенью деацетилирования 95%, молекулярной массой 450 кДа в количестве 40 г, соответствующем концентрации раствора 4 мас. %, при этом количество нанофибрилл хитина составляет 0,1% от массы хитозана.

Диаметр пор 10-100 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=6.4 МПа, во влажном - Е=0.07 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 7 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №3. В условиях примера №1, при получении материала используется хитозан со степенью деацетилирования 60%, молекулярной массой 50 кДа в количестве 40 г, соответствующем концентрации раствора 4 мас.%, при этом количество нанофибрилл хитина составляет 50% от массы хитозана.

Диаметр пор 1-300 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=8.2 МПа, во влажном - Е=0.09 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 5 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №4. В условиях примера №1, при получении материала используется концентрация хитозана в растворе 0,1 мас. %, при этом количество нанофибрилл хитина составляет 40% от массы хитозана.

Диаметр пор 300-1000 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=1.1 МПа, во влажном - Е=0.01 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 1 неделю экспозиции в подопытном животном.

Пример №5. В условиях примера №1, при получении материала используется концентрация хитозана в растворе 10 мас. %, при этом количество нанофибрилл хитина составляет 1% от массы хитозана.

Диаметр пор 1-50 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=15.3 МПа, во влажном - Е=0.1 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 8 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №6. В условиях примера №1, при получении материала используется пластификатор глицерин в количестве 0,4 г, что соответствует 1% от массы хитозана.

Диаметр пор 10-800 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=4.4 МПа, во влажном - Е=0.06 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 6 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №7. В условиях примера №1, при получении материала дополнительно используется биорезорбируемый полимер полигиалуроновая кислота в количестве 4 г, что соответствует 10% от массы хитозана.

Диаметр пор 1-600 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=6.2 МПа, во влажном - Е=0.05 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 5 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №8. В условиях примера №1, охлаждение раствора хитозана проводилось до температуры -196°C.

Диаметр пор 1-10 мкм, модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=6.8 МПа, во влажном - Е=0.07 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 6 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №9. В условиях примера №1, материал подвергался термообработке при температуре 120°C в течение 60 мин.

Модуль упругости полученного материала в сухом состоянии Е=6.4 МПа, во влажном - Е=0.06 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 6 недель экспозиции в подопытном животном.

Пример №10. В условиях примера №1, материал пропитывают 0,1% раствором антисептика (фурацилина), 10% раствором пластификатора (глицерина), 50% раствором биорезорбируемого полимера (желатина). Модуль упругости полученного материала в сухом состоянии E=3.4 МПа, во влажном - E=0.02 МПа. После выдержки в водной среде образец не изменил форму и размеры, после сушки форма и размеры также не изменились.

Полная биорезорбция материала наблюдалась через 4 недели экспозиции в подопытном животном.

Из приведенных данных следует, что введение нанофибрилл хитина повышает формоустойчивость композитного материала в сухом и влажном состоянии, что свидетельствует о стабилизации его структуры, сохранении сквозного характера пор, это способствует свободной миграции клеток, диффузии питательных веществ и газов во всем объеме материала. Высокая эластичность и достаточная прочность позволяют использовать предлагаемый материал в виде раневых покрытий и гемостатических тампонов. При этом, введение биорезорбируемого нанофибрилл хитина не вызывает токсического воздействия на окружающие клетки и ткани, материал подвергается полной биодеградации в течение нескольких недель.

Раскрытие способа и указанный полученный результат свидетельствуют о соответствии данного технического решения критериям изобретения: «новизна», «промышленная применимость» и «изобретательский уровень».