Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧЕРНОМОРСКОЙ КРАСНОЙ ВОДОРОСЛИ GELIDIUM SPINOSUM (GREV.) BORN. ET THUR (RHODOPHYTA)

Изобретение относится к области аквакультуры и может быть использовано при культивировании черноморской красной агароносной водоросли Gelidium spinosum (Grev.) Born. et Thur в береговых системах инженерного типа.

Агар из гелидиума отличается высоким качеством, но наиболее ценными являются фикобилипротеины, которые используются в имунной диагностике, микроскопии цитометрии, а также как естественные красители в парфюмерии и кондитерской промышленности.

Известен "Способ культивирования черноморской красной водоросли Gelidium latifolium (Grev.) Born. et Thur. (Rhodophita)" (патент UA №96379 C2, МПК A01К 61/00, A01G 33/00, 25.10.2011.), который предусматривает недельную циклическую технологию, включающую фазы «отдыха» при температуре 10-12°С и дневной освещенности 0,2-0,5 кЛк, приготовление питательной среды на основе фильтрованной черноморской воды, соленость которой с целью подавления эпифитов доводят до 26‰, засев среды фрагментами гелидиума с начальной плотностью 2-2,5 кг/м², выращивание при освещенности на поверхности воды 18-20 кЛк в режиме «16 - день, 8 - ночь», температуре питательной среды 15-19°С - в феврале, марте и ноябре, 19-23°С - в апреле, мае, сентябре и октябре и 23-27°С - в летние месяцы, барботирование среды сжатым воздухом, обеспечивающее объемное вращение водорослей, поддержание pH среды на уровне 7,9-8,2 путем добавления углекислоты из расчета 25-30 г на 1 кг водорослей в сутки, проток среды, обеспечивающий ее полную или двукратную замену в сутки, которую в начале цикла насыщают биогенами, из расчета 4,8-7,2 мг/л азота в виде 35-52 мг/л KNO₃ или 29-44 мг/л NaNO₃ и 0,8-1,2 мг/л фосфора в виде 4,9-7,4 мг/л KH₂PO₄⋅3H₂O или 4,5-6,7 мг/л NaH₂PO₄⋅3H₂O, увеличивая ежедневно норму в соответствии с увеличением биомассы, сбор урожая и отбор для последующих циклов наиболее чистых от обрастаний водорослей, а в качестве стимулятора роста добавляют 0,35-0,45 мг/л хелатированного железа в виде 1,68-2,16 мг/л FeCl₃⋅6H₂O с добавлением 13-17 мг/л Nа₂ЭДТА и в начале каждого цикла температуру питательной смеси в течение 36-48 часов удерживают вблизи верхней границы диапазона, оптимального для текущего периода, снижая ее затем к нижней границе диапазона.

Недостатком данного способа является то, что он не обеспечивает максимальный выход R-фикоэритрина, который является наиболее ценным продуктом культивируемого гелидиума.

Во-первых, использование хлорного железа в виде FeCl₃⋅6H₂O в указанных количествах в качестве стимулятора роста биомассы приводит к одновременному снижению процентного содержания фикоэритрина, которое не восстанавливается за время «отдыха» в аквариуме, через который не осуществляют проток питательной среды.

Во-вторых, нерегламентированное повышение солености питательной среды до для подавления эпифитов, например, с помощью поваренной соли, приводит к уменьшению процентного содержания таких металлов, как марганец и магний, совершенно необходимых при фотосинтезе, которые активируют ферменты, участвующие в процессе фосфорилирования [1], но в процессе производства поваренной соли они удаляются вместе с другими примесями. Это также не способствует увеличению содержания фикоэритрина в культивируемом гелидиуме.

Кроме того, осуществление ежедневного повышения концентрации биогенов при постоянном протоке питательной среды представляет сложную многоцелевую, многоступенчатую задачу регулирования отдельно по каждому из биогенов

Задачей изобретения является оптимизация процесса наращивания биомассы объекта с увеличением накопления в ней R-фикоэритрина.

Техническим результатом изобретения является увеличение выхода фикоэритрина с единицы площади культиваторов. По сравнению с известным способом культивирования гелидиума на аналогичном оборудовании при подобных условиях по освещенности и температуре, одинаковых энергетических затратах за 8 недель культивирования предложенным способом было получено чистого R-фикоэритрина в 2,8-2.9 раз больше.

Технический результат достигается за счет изменения состава питательной среды и совершенствования технологии доставки питательных веществ. Для этого в известном циклическом способе культивирования гелидиума, включающем фазы «отдыха» в аквариуме при температуре 10-12°С и дневной освещенности 0,2-0,5 кЛк, приготовление питательной среды на основе фильтрованной черноморской воды, соленость которой для подавления эпифитов доводят до , засев культиваторов фрагментами гелидиума с начальной плотностью 2-2,5 кг/м², выращивание при освещенности на поверхности воды 18-20 кЛк в режиме «16 - день, 8 - ночь», температуре питательной среды 15-19°С - в феврале, марте и ноябре, 19-23°С - в апреле, мае, сентябре и октябре и 23-27°С - в летние месяцы, барботирование среды сжатым воздухом, обеспечивающее объемное вращение водорослей, поддержание pH среды на уровне 7,9-8,2 путем добавления углекислоты из расчета 25-30 г на 1 кг водорослей в сутки, проток среды, обеспечивающий ее полную или двукратную замену в сутки, которую в начале цикла насыщают биогенами, из расчета 4,8-7,2 мг/л азота в виде 35-52 мг/л KNO₃ и 0,8-1,2 мг/л фосфора в виде 4,9-7,4 мг/л KH₂PO₄⋅3Н₂О, увеличивая ежедневно норму в соответствии с увеличением биомассы, сбор урожая и отбор для последующих циклов наиболее чистых от обрастаний водорослей, а в качестве стимулятора роста добавляют 0,35-0,45 мг/л хелатированного железа в виде 1,68-2,16 мг/л FeCl₃⋅6Н₂О с добавлением 13-17 мг/л Na₂ЭДТА и в начале каждого недельного цикла температуру питательной смеси в течение 36-48 часов удерживают вблизи верхней границы диапазона, характерного для текущего периода, снижая ее затем к нижней границе диапазона, дополнительно при повышении солености питательной среды с помощью поваренной соли вносят на литр среды 100 мг магния в виде 1,03 г MgSO₄⋅7H₂O и марганец из расчета 0,69 мг/л в виде 2,47 мг/л MnCl₂⋅4Н₂О, хлорное железо в питательной среде заменяют сернокислым из расчета 1,16 мг железа на литр среды в виде 5,76 мг/л FeSO₄⋅7H₂O, предварительно проваренном в дистилляте совместно с 15 мг/л Nа₂ЭДТА, азот вносят в количестве 6 мг/л в виде 43,5 мг/л KNO₃, а фосфор - 1 мг/л в виде 6,15 мг/л KH₂PO₄⋅3Н₂О, проток среды через культиваторы делают переменным - от 1-1,7 объема в начале цикла до 1,6-2-х объемов в сутки в конце, ежедневно увеличивая его на 10-5%, при этом от средины и до конца очередного цикла поддерживают среднюю температуру, характерную для данного периода, и устанавливают постоянный проток через аквариум в фазе «отдыха» до 0,05 объема в сутки.

В известном способе добавляют соли, содержащие азот, фосфор, железо, марганец и магний из расчета 43,5 мг/л KNO₃ или 36,5 мг/л NaNO₃; 6,15 мг/л KH₂PO₄⋅3Н₂О или 5,6 мг/л NaH₂PO₄⋅3H₂O, но так как добавление разных солей особого преимущества не дает, то будем использовать лишь соли KNO₃ и KH₂PO₄⋅3H₂O.

Способ реализуют следующим образом. В период благоприятной гидрологической и метеорологической обстановки прибрежную черноморскую воду соленостью 17,5- и уровнем рН - 8,0-8,5 закачивают в резервуар-накопитель. Из него воду порционно подают в резервуар-смеситель, в который добавляют поваренную соль из расчета 8,5-7,5 г/л, а также соли, содержащие азот, фосфор, железо, марганец и магний из расчета 43,5 мг/л KNO₃; 6,15 мг/л KH₂PO₄⋅3Н₂О; 5,76 мг/л FeSO₄⋅7H₂O, предварительно проваренных в дистилляте совместно с 15 мг/л Nа₂ЭДТА; 2,47 мг/л MnCl₂⋅4H₂O и 1,03 г/л MgSO₄⋅7H₂O. Через систему механических фильтров и теплообменников полученной питательной смесью заполняют расположенный в прохладном месте многосекционный аквариум и культиваторы, оснащенные устройствами для барботирования воды.

Гелидиум, собранный в феврале - ноябре в местах естественного обитания, предварительно очищают от примесей и обрастаний и размещают в секциях аквариума с общим объемом питательной смеси 250 л, пропущенной через фильтр и теплообменник, температура которой не превышает 10-12°С, а освещенность на ее поверхности в дневное время не превышает 0,5 кЛк, и устанавливают проток среды 0.05 об/сут (≈0,5 л/ч). Этой же питательной смесью из резервуара-обогатителя, заполняют культиваторы с наклонным дном, оснащенные перфорированными воздухопроводами в глубокой части и расположенными на противоположных стенках мелкодисперсными распылителями СО₂ и его уловителями (газообменниками). Культиваторы выполняют так, чтобы их глубина не превышала поперечные размеры более чем в 1,5-1,7 раза, а со стороны газообменников дно делают скошенным для облегчения создания объемной циркуляции объемов воды вместе с водорослями. Водорослями из пронумерованных (нечетных) секций аквариума загружают культиваторы из расчета 2-2,5 кг/м² (20-25 г/дм²), но не более, чем 5 г/л, регулируют подачу сжатого воздуха в воздухопровод так, чтобы создать равномерное объемное вращение водорослей в питательной среде, а подачу углекислоты из расчета 25-30 г на кг водорослей в сутки так, чтобы пузырьки газа не всплывали в противотоке воды, а увлекались вниз и растворялись в ней. Устанавливают в начале первого (нечетного) недельного цикла через культиваторы №№1, 2 и т.д. протоки питательной среды от 1 до 1,7 объема в сутки, увеличивая их ежедневно на 10-5% соответственно. Устанавливают освещенность на поверхности воды в культиваторах на уровне 20 кЛк, а температуру питательной среды на выходе соответствующих теплообменников регулируют так, чтобы первые двое суток цикла она была близкой к верхней границе, а последующие 4-5 суток - к средней границе диапазона, характерного для сезона культивирования.

Через 6-7 суток перекрывают подачу питательной среды в культиваторы, водоросли извлекают на плоский светлый поддон, промывают струей воды, очищая от примесей и эпифитов, взвешивают и возвращают в аквариум обратно в первую (нечетные) секции.

Культиваторы чистят, промывают и загружают водорослями из четных секции аквариума для второго (четного) цикла, после завершения которого водоросли возвращают в аквариум в свободные четные секции.

Далее очищенные культиваторы заполняют питательной средой и загружают водорослями из нечетных секции, в которых они «отдыхали» в течение предыдущих 6-7 суток, отбирая для третьего (нечетного) цикла исходный вес из наиболее целых и чистых талломов, а приросты первого цикла (предыдущего нечетного) используют в качестве урожая, предварительно определив в них процент абсолютно сухого вещества и содержание в нем R-фикоэритрина. По завершении последнего четного цикла водоросли неделю выдерживают в аквариуме, после чего делают соответствующие измерения.

Пример реализации способа.

Выращивание гелидиума с недельным циклом проводили в марте - апреле в двух культиваторах размером 0,3⋅0,3⋅0,5 м (площадью 0,09 м², объемом 45 л) при температуре 18-22°С, освещенности 20±0,3 кЛк, которую выключали на 8 часов в ночное время (с 22⁰⁰ до 6⁰⁰). Температуру в аквариуме объемом 250 л, где отдыхали водоросли, поддерживали на уровне 10-12°С, освещенность в дневное время - не более 0,5 кЛк, а проток питательной среды установили в пределах 0,5 л/ч. Для ее приготовления в черноморскую воду соленостью добавляли на каждый литр 8,5 г поваренной соли, 43,5 мг KNO₃, 6,15 мг KH₂PO₄⋅3Н₂О, 5,76 мг FeSO₄⋅7H₂O, предварительно проваренные в дистилляте совместно с 15 мг Nа₂ЭДТА, а также 2,47 мг MnC1₂⋅4H₂O и 1,03 г MgSO₄⋅7H₂O.

В культиваторы №1 и №2, заполненные фильтрованной питательной смесью, из секций 1 и 3 аквариума, загруженного посекционно необходимым исходным количеством материала, поместили 180 и 225 г гелидиума. Через культиваторы установили протоки питательной средой в начале первого недельного цикла: №1 - 2 л/ч, увеличивая его ежедневно на 0,2 л/ч, и №2 - 3 л/ч, увеличивая его на 0, 15 л/ч. Температуру питательной среды на входе в культиваторы первые 48 часов первого мартовского цикла поддерживали на уровне 18-19°С, а в последующие 5 суток - на уровне 17°С. Эти диапазоны температуры увеличивали от цикла к циклу на 0,5-1°С, так что в последнем апрельском цикле они составили 22-23°С и 21°С соответственно.

В культиватор №1 подавали 4,5 г углекислоты в сутки, а в культиватор №2 - 5,6 г, установив необходимый режим барботирования.

Через 7 суток произвели взвешивание сырых биомасс гелидиума и, промыв их, вернули в секции 1 и 3 аквариума, а в очищенные культиваторы загрузили 180 и 225 г гелидиума из секций 2 и 4. Культивирование проводили при тех же условиях по освещению, и питанию, что и в первом цикле. По окончании второго цикла гелидиум промыли, взвесили и вернули в секции 2 и 4 аквариума. Перед запуском третьего цикла освободили секции 1 и 3, отобрали соответственно 180 и 225 г наиболее чистых и здоровых талломов и загрузили в культиваторы №1 и №2, а приросты биомассы использовали в качестве урожая, измерив в них содержание R-фикоэритрина. По окончании восьмого цикла культивирования провели измерение биомасс в культиваторах №1 и №2, а через неделю после «отдыха» в аквариуме - содержание в них R-фикоэритрина. Удельные скорости весового роста гелидиума на каждом цикле (μ), приросты биомассы в культиваторах (ΔW), процентные содержания в них абсолютно сухого вещества (АСВ) и содержание R-фэ приведены в таблице 1.

Суммарный урожай (прирост) сырой массы для культиватора №1 за 8 недель составил 440,5 г, или 87,4 г/м² сутки. Из нее получилось 2447,3 мг или 485,6 мг/м²⋅сутки чистого R-фикоэритрина. При минимальном содержании АСВ в сырой массе 36,1% и минимальном содержании в нем R-фэ до 1,2% (12 мг/г) обеспечивается урожай 378,6 мг/м²⋅сутки или 1136 кг чистого R-фикоэритрина с одного гектара зеркальной площади культиваторов в год при непрерывной их работе 300 дней в году.

Для культиватора №2 урожай сырой массы - 529,2 г, или 105,0 г/м²⋅сутки, и 2646,6 мг или 525 мг/м²⋅сутки чистого R-фикоэритрина. При минимуме содержания в сырой массе АСВ до 36,5% и R-фэ в нем до 1,27% (12,7 мг/г) его урожай составит 487 мг/м²⋅сутки или 1460 кг чистого R-фикоэритрина с одного гектара зеркальной площади культиваторов в год при непрерывной их работе 300 дней в году.

Источники информации

1. Терлецкий Е.Д. Металлы, которые всегда с тобой. Москва: Знание, 1986. 144 с. [Terletskii E.D. Metally, kotorye vsegda s toboi. Moscow: Znanie, 1986, 144 p.].