СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ИЗ ГОНАД МИДИЙ M. GALLOPROVINCIALIS, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения лекарственных веществ из гидробионтов и может быть использовано в медицине для создания препаратов, которые обладают противоопухолевой активностью.

Известно, что мясо мидий обладает широким спектром положительных медико-биологических свойств. Ранее было разработано несколько типов лечебно-профилактичнских продуктов, полученных путем глубокой переработки мягких тканей мидий или из целых моллюсков: МИГИ-К [1], "Биоплан" [2]. В гонадах мидий, культивируемых в Крыму, обнаружены вещества разной природы: биологически активные вещества с высоким содержанием тестостерона [3] биоантиоксиданты, иммуномодуляторы [4]. Проведенные клинические испытания показали, что экстракты из гонад мидий оказывают иммуномодулирующее действие [4] и могут быть использованы в ликвидации последствий воздействия ионизирующего излучения. На основании имеющихся данных о химическом составе гонад моллюсков, а также опыта их использования, нами предлагается способ получения продукта на основе гонад М. galloprovincialis, обладающего противоопухолевой активностью.

Известен способ получения вещества, обладающего противоопухолевой активностью, из гонад коллекторных мидий Mytilus galloprovincialis Lam путем экстракции смесью хлороформ:спирт (Пат. №4106, Украина, 2004, A61K 35/56). В известном способе из черноморских мидий Mytilus galloprovincialis выделяют сырые гонады. Для получения гонад используют мидии 3-4-ой стадии половозрелости по пятибалльной шкале. Сырые гонады гомогенизируют в смеси хлороформ:этанол (1:1), центрифугируют, и остаток повторно гомогенизируют в смеси хлороформ:этанол (2:1). Экстракт трижды отмывают водой от нелипидных примесей. Хлороформную фракцию упаривают в вакууме при температуре ниже 30°C. К полученному липидному остатку добавляют гексан и 85% водный спирт в соотношении 2:1 и смесь встряхивают в делительной воронке. Гексановую фракцию отделяют, а водно-спиртовую фракцию экстрагируют гексаном дважды. Гексановые фракции объединяют и упаривают в вакууме до постоянной массы. Недостатком известного способа является длительность процесса и сравнительно низкий выход.

Задачей изобретения Способ получения вещества из гонад мидий M. galloprovincialis, обладающего противоопухолевой активностью является увеличение конечного выхода вещества, обладающего противоопухолевой активностью и упрощение способа экстракции вещества из гонад мидий.

Техническим результатом изобретения является получение вещества, обладающего противоопухолевой активностью в количестве, достаточном для использования в медицине качестве сырья для изготовления новых лекарственных препаратов.

Технический результат достигается путем гомогенизации гонад, находящихся исключительно на 4-5 стадиях половозрелости, при температуре (37±1)°C в хлороформно:спиртовой смеси в соотношении (1:1), что в значительной мере увеличивает экстракцию целевого вещества, отмывании при температуре (25-30)C° полученного экстракта водой от нелипидных примесей и добавлении к полученному липидному остатку гексана и 85% водного спирта в соотношении 1:1. Такая методика приводит к увеличению выхода конечного продукта на (12-13) % и уменьшает время экстракции (1,5-2) раза. Значения количественных параметров заявляемого способа, режимы и условия экстрагирования экспериментально установлены авторами в оптимальных границах достижения технического результата.

В предлагаемый способ, включающий экстракцию активного вещества из гонад мидий М. Galloprovincialis спирто-хлороформной смесью (1:1) в с последующим отделением органической фазы, выпариванием ее в вакууме при температуре (25-30)°C, растворением в гексане с добавлением 85% водного спирта, отделением гексановой фракции от водно-спиртовой, которую экстрагируют гексаном, объединением полученных гексановых фракций и выпариванием в вакууме при температуре (25-30)°C до постоянной массы, вводятся новые условия. Во-первых, используют мидии, находящиеся на 4-5 стадиях половозрелости по пятибалльной шкале. Во-вторых, экстракцию активного вещества из гонад мидий спирто-хлороформной смесью проводят при температуре (37±1)°C в течение 30 минут. В-третьих, экстракцию водно-спиртовой фракции гексаном выполняют один раз.

Признаками, совпадающими с прототипом, являются: выделение сырых гонад из черноморских мидий М. galloprovincialis и их гомогенизация в смеси хлорофом:этанол (1:1), а затем центрифугирование; отмывание экстракта водой от нелипидных примесей; упаривание хлороформнной фракции в вакууме при температуре ниже 30°C; добавление к полученному липидному остатку гексана и 85% водного спирта в соотношении 1:1, отделение гексановой фракции и экстрагирование водно-спиртовой фракции гексаном: объединение гексановых фракций и упаривание в вакууме до постоянной массы.

Способ реализуется следующим образом.

Из черноморских мидий М. galloprovincialis выделяют сырые гонады, преимущественно находящиеся на 4-5 стадиях половозрелости по пятибалльной шкале. Сырые гонады гомогенизируют в смеси хлороформ:этанол (1:1) при температуре (37±1)°C в течение 30 минут, центрифугируют. Повторной экстракции не требуется. Экстракт дважды отмывают водой от нелипидных примесей при температуре (25-30) C°. Хлороформную фракцию упаривают в вакууме при температуре (25-30)°C. К полученному липидному остатку добавляют гексан и 85% водный спирт в соотношении 1:1, смесь встряхивают в делительной воронке. Гексановую фракцию отделяют, а водно-спиртовую фракцию экстрагируют гексаном еще однин раз. Гексановые фракции объединяют и упаривают при температуре (25-30)°C в вакууме до постоянной массы. Примеры реализации способа.

Пример 1. Из 4 кг мидий Mytilus galloprovincialis, выращенных в Крымских хозяйствах марикультуры, выделяли 120 г сырых гонад. Сырые гонады гомогенизировали в смеси хлороформ:этанол (1:1) при температуре 37°C в течение 30 минут, центрифугировали. Экстракт дважды отмывали водой от нелипидных примесей. Хлороформную фракцию упаривали в вакууме при температуре 30°С.К полученному липидному остатку добавляли гексан и 85% водный спирт в соотношении 1:1. Смесь встряхивали в делительной воронке. Гексановую фракцию отделяли, а водно-спиртовую фракцию экстрагировали гексаном еще одни раз. Гексановые фракции объединяли и упаривали при температуре (25-30)°C в вакууме до постоянной массы. Выход конечного продукта составил 0,6 г на 100 г сырой массы гонад. Получали липидную фракцию с содержанием α-токоферола 48 мг на 1 г (на жидкостном хроматографе).

Пример 2. Из 20 г гонад черноморских мидий, используя приемы, описанные в примере 1, получали липидную фракцию с выходом 0,17 г. Содержание α-токоферола, определенное методом жидкостной хроматографии, - 57 мг на 1 г липидной фракции.

Противоопухолевая активность полученного препарата согласовывается с активностью препарата, полученного по известному способу. Вещество, полученное предложенным способом, обладает низкой токсичностью и не вызывает гибели мышей, а также других токсических явлений при изученной схеме лечения. В предложенном авторами способе не используются дорогостоящие методы экстракции и очистки, а выход конечного продукта выше на (12-13) % при сохранении показателей противоопухолевой активности. Преимущество способа получения вещества, обладающего противоопухолевой активностью, заключается в доступности сырьевой базы и в высоком выходе целевого продукта. Способ не требует сложных и дорогих методик выделения. Полученное вещество отличается низкой токсичностью и может быть использовано для создания нового препарата для лечения онкологических больных.

Заявленный способ позволяет увеличить выход конечного продукта на (12-13) %, уменьшает в (1,5-2) раза время экстракции, и, не угнетая природных качеств препарата, сохраняет показатели противоопухолевой активности.

Источники информации, принятые во внимание:

Рехина, Н.И.; Новикова, М.В.; Беседина, Т.В.; Королев, А.Н.; Терентьев, В.А. Пищевой продукт из мидий для лечебно-профилактического применения. // Рыбное хозяйство - 1995 - №4. - С. 53-56.

2. Симонова Л.И, Григорьева М.П. Битютская О.Е. Изучение адаптогенного действия биодобавки Биоплан. // Рыбное хозяйство Украины - 2001 - №3-4. - С. 17-18.

3. Пат. 2599834 Российская Федерация. МПК A23L 33/10, A23L 17/50. Способ получения биологически активного вещества из черноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam / Никонова Л.Л. (RU), Нехорошев М.В. (RU); патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт морских биологических исследований им. А.О. Ковалевского РАН» (RU). - №2014138314/13; заявл. 22.09.2014; опубл. 20.10.2016, Бюл. №29

4. Г.Н. Апрышко, М.В. Нехорошее. Противоопухолевые препараты из морских организмов. "Аквавита", Севастополь, 2000, стр. 106

5. Пат. 4106 UA, МПК A01K 35/56. Спосiб одержання речовини, яка протипухлинну активнiсть / Нехорошев М.В. (UA), Фiлiппов О.В. (UA), Усс Ю.А. (UA), Апрiшко Г.Н. (RU), . (RU), Судакова Л.А. (RU), Фiрсова Г.А. (RU); заявник Iнститут пiвденних морiв iм. О.О. Ковалевського HAH (UA). - №2004010067; Заявл. 08.01.2004; Опубл. 17.01.05. Бюл. №1.