Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской диагностике, и предназначено для регистрации специфических макромолекул, связанных с заболеваниями, в биологических пробах крови, плазмы, тканевого материала и т.д.

Диагностическая тест-система на основе компакт-диска - это медицинская диагностическая система, использующая в качестве чувствительного элемента лазерный компакт-диск с нанесенными на него макромолекулярными зондами, специфичными к макромолекулярным маркерам, связанными с заболеваниями, и в качестве измерительного устройства - устройство привода считывания лазерных компакт-дисков.

Задача своевременной диагностики инфекционных заболеваний, в том числе гепатитов, а также онкологических заболеваний, имеет большое значение. Среди гепатитов выделяются заболевания гепатитом С. Это связано с тем, что острая HCV-инфекция в 80% переходит в хроническую, которая может привести к циррозу печени или гепатоцеллюлярной карциноме. Заболевания HCV сопровождаются появлением в крови больного антител к кор белку вируса гепатита С (анти-HCVcore). Поэтому выявлению анти-HCVcore в сыворотке крови отводится ключевая роль в диагностике заболеваний, вызванных вирусом гепатита С. Сывороточный амилоид A (SAA) является белковым маркером, который может быть связанным с онкологическими заболеваниями и обнаруживается в крови людей. Во многих случаях повышение концентрации SAA наблюдается уже на ранних стадиях рака [1].

В настоящее время основными методами определения маркеров заболеваний являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В ИФА антитела, иммобилизованные на подложке, инкубируются в сыворотке крови, содержащей антигены, после чего к образованным на подложке комплексам антиген/антитело добавляются вторичные антитела с ковалентно «пришитыми» молекулами ферментов (пероксидазы или щелочной фосфатазы). После завершения реакции комплексообразования в среду добавляются субстраты для названных ферментов, дающие после гидролиза цветную реакцию, пропорционально количеству связавшихся вторичных антител, что и отражает содержание антигена в исследуемой пробе.

В ПЦР происходит амплификация с помощью полимеразы участков ДНК вируса заболевания с последующей регистрацией полученных таким образом набором олигонуклеотидов.

Несмотря на высокую чувствительность методы ИФА и ПЦР имеют ряд недостатков: длительность и сложность постановки, отсутствие жесткого контроля качества тест-систем, возможность загрязнения исследуемых образцов ДНК или РНК (в случае ПЦР), высокая стоимость реактивов и приборов.

В настоящее время в фармакологических, протеомных исследованиях и медицинской диагностике нашли применение методы оптического биосенсора на основе анализа гибридизации специфической ДНК-пробы с ДНК исследуемого образца (мишени) [2] и на основе регистрации формирования белковых иммунокомплексов по увеличению коэффициента преломления в зоне реакции [3]. Последний метод позволяет в реальном времени с высокой чувствительностью регистрировать маркеры заболевания в биологической жидкости. К его недостаткам относится высокая стоимость измерительного устройства.

В настоящее время известны работы по регистрации молекулярных комплексов, формируемых на поверхности, с помощью мониторинга коэффициента преломления на поверхности компакт-диска [4]. Появившийся в конце 1990 - начале 2000 г. метод регистрации белок-белковых взаимодействий с помощью CD-ROM [5] характеризуется возможностью определять образование комплексов, быстротой анализа и самое немаловажное - дешевизной. В этом методе поликарбонатная поверхность компакт диска, в котором имеется запись последовательных цифровых данных в виде выпуклых и вогнутых мест, называемых "land" и "pit", активируется и конъюгируется биомолекулами лиганда, создавая повышенный уровень ошибок. Повышение уровня ошибок чтения устройством CD-ROM, возникающее при появлении биологических молекул на поверхности диска и вызываемое изменением интерференционной картины из-за изменения коэффициента преломления на поверхности диска, отслеживается путем сравнения этого уровня ошибок с базовым уровнем. То есть создается прямая корреляция между цифровыми данными, записанными на диске, и биологическими данными на диске, обеспечивая распознающий элемент. Диск читается стандартным CD-ROM с использованием персонального компьютера. Дешевизна связана с отсутствием специально сконструированных регистрирующих устройств; вместо них используется CD-ROM персонального компьютера, а в качестве основы для изготовления биочипа используется компакт-диск.

Для ковалентной иммобилизации молекул на поверхности компакт-диска она модифицируется. Для модификации поликарбонатная поверхность компакт-диска обрабатывается, например, смесью дихлор-(N,N)-диизопропил- аминофосфата с этил-(N,N)-диизопропиламином [5]. Далее на эту поверхность пришивается спейсер - полиэтиленгликоль с альдегидной группой, позволяющей проводить иммобилизацию зондов с сайт-специфической группой. К альдегидной группе рецептора ковалентно иммобилизуется проба (в частности, биотинилированная в слое смолы). Диск с этим слоем с помощью первого луча лазера двухлазерного плеера считывается и информация запоминается в памяти компьютера, а затем вторым лазером проводится разогрев поверхности диска, что инициирует реакцию связывания биотинилированной пробы - зонда со структурой на поверхности рецептора. Это приводит к появлению ошибок считывания устройством CD-ROM. Затем после инкубации иммобилизованных зон зондов в растворе, содержащем модельные очищенные белки, получаются комплексы зонд/модельный белок, что приводит к появлению других ошибок считывания. Увеличение ошибок после инкубации зон компакт-диска с зондами в растворе дает возможность зарегистрировать формирование белковых комплексов.

Наиболее близким по существенным признакам к предлагаемому техническому решению по созданию диагностики инфекционных и соматических заболеваний является способ для регистрации белок-белковых взаимодействий с помощью компакт-диска белков. Недостатком данного способа является ограниченность класса макромолекул, которые могут быть использованы в качестве зондов; а именно не могут быть использованы молекулы, не содержащие аминогруппы, например олигонуклеотидов, не содержащие аминогрупп, апатамеров, белов, имеющих аминогруппы в местах контактов иммунокомплексов и т.д., что ограничивает возможности использовать ее для создания диагностических систем. Кроме того, использование альдегидной группы в спейсере, как описано в [5], не позволяет повышать чувствительность за счет иммобилизации к спейсеру более одной молекулы-зонда, что понижает потенциал повышения чувствительности данной системы. Кроме того, процесс производства системы, упомянутой в [5], включает использование экологически вредных хлорсодержащих соединений, что представляет серьезную проблему в случае адаптации и тиражирования данной системы для диагностических целей. Также близким по существенным признакам к предлагаемому техническому решению по созданию диагностики инфекционных и соматических заболеваний является нанодиагностический способ для для выявления вируса гепатита, основанный на использовании оптического биосенсора [5]. В данном способе производится измерение изменения резонансных оптических свойств среды при образовании комплексов, например иммобилизованного на поверхности антител HBSAg из аналита, для диагностики гепатита В.

Недостатком данного способа использования оптического биосенсора является необходимость применения дорогостоящего оборудования для регистрации изменения коэффициента преломления среды на поверхности резонансной структуры по мониторингу смещения резонансного угла прохождения (поглощения) зондирующего излучения. Одним из подходов по удешевлению и упрощению системы регистрации изменения коэффициента преломления среды на поверхности резонансной структуры является использование системы CD-ROM в диагностике заболеваний.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в создании нового способа и устройства для выявления маркеров инфекционных и соматических заболеваний для диагностики заболеваний на основе компакт-диска и устройства считывания лазерных компакт-дисков.

Технический результат, который достигается при использовании изобретения, состоит в упрощении и удешевлении процедуры регистрации, а также в повышении чувствительности диагностической тест-системы.

Технический результат достигается за счет того, что в способе регистрации специфических макромолекул, например антител, антигенов, нуклеиновых кислот, в биологических пробах, включающем использование лазерного компакт-диска, поликарбонатная поверхность которого предварительно модифицирована с помощью азидных производных полем ковалентно иммобилизованных молекул, способных формировать специфические комплексы с макромолекулярными маркерами заболеваний, например антителами антигенами, нуклеиновыми кислотами, причем поле иммобилизованных молекул создано посредством фотоиммобилизации указанных молекул на поверхность диска через активные кросслинкеры, помещают на поверхность компакт-диска биологическую пробу, считывают с поверхности диска отраженный оптический сигнал, выявляют уровни оптического сигнала, соответствующего ошибкам первого рода, обусловленным наличием на поверхности диска иммобилизованных молекул и/или их комплексов, не связанных с маркерами, затем выявляют уровни сигнала, соответствующего ошибкам второго рода, обусловленным наличием комплексов, специфических к заболеванию маркеров с иммобилизованными молекулами, подсчитывают ошибки первого и второго рода, сравнивают их количества и делают вывод о наличии в биологической пробе маркера по преобладанию количества ошибок второго рода.

При этом биологическая проба представляет собой раствор биологической жидкости, в том числе сыворотки крови, плазмы крови, экстракт тканевого материала и т.д.

В качестве иммобилизованных молекул могут быть белки, фрагменты белков, пептиды, олигонуклеотиды.

Иммобилизованные молекулы способны к образованию комплексов со специфическими к заболеваниям маркерами, например антигенами, антителами, нуклеиновыми кислотами.

Технический результат достигается также за счет того, что используется система регистрации макромолекулярных маркеров заболеваний, например антител, антигенов, нуклеиновых кислот, в биологической пробе, включающая оптический компакт-диск, поверхность которого предварительно модифицирована с помощью азидных производных полем ковалентно иммобилизованных молекул, способных формировать специфические комплексы с макромолекулярными маркерами заболеваний, и на которую нанесена проба биологической жидкости, причем поле иммобилизованных молекул создано посредством фотоиммобилизации указанных молекул на поверхность диска через активные кросслинкеры;

- устройство считывания лазерных компакт-дисков, отраженного с поверхности оптического диска сигнала, создаваемого лучом лазера, включающее устройство обработки сигнала, имеющее возможность выявления уровней сигнала, соответствующего ошибкам первого рода, обусловленным наличием на поверхности диска иммобилизованных молекул и/или комплексов, не связанных с маркерами; выявления уровней сигнала, соответствующего ошибкам второго рода, обусловленным наличием комплексов специфических к заболеванию маркеров с иммобилизованными молекулами, подсчета ошибок первого и второго рода, сравнения количества ошибок и установления факта наличия в биологической пробе маркера по преобладанию ошибок второго рода; и

- связанное с ним устройство отображения информации, имеющее возможность отображения информации о поверхности диска с секторами, соответствующими зарегистрированным специфическим к заболеванию маркерам.

Для решения поставленной задачи разработаны способ и диагностическая тест-система для выявления инфекционных заболеваний (на примере гепатита С) и соматических заболеваний (на примере сывороточного амилоида А), включающие использование устройства считывания лазерных компакт-дисков с биочипом, который представляет из себя компакт-диск, к поликарбонатной поверхности которого в определенной последовательности ковалентно иммобилизуются зоны молекулярных зондов - антигенов (антител), и образующие чувствительный слой.

Схема иммобилизации антигенов (антител) на поверхности CD-диска следующая. Для иммобилизации белка на поверхности компакт-диска создана схема, использующая азидные производные фото-кросслинкера для ковалентной иммобилизации спейсера (как на основе полиэтиленгликоля, так и силанов) к поверхности компакт-диска, и схема использования азидных производных для пришивки к спейсеру зонда-белка (антигена либо антитела). Для этого на поверхность диска наносится спейсер, не содержащий альдегидную группу. Спейсер с помощью фото-кросслинкера ковалентно иммобилизуется на поверхности диска. Это позволяет получить слой спейсера, устойчивый к многократным процедурам обработки поверхности в процессе иммобилизации зондов и вылавливании с помощью них из раствора макромолекулярных маркеров. Это является преимуществом перед способами нековалентной иммобилизации спейсера и представляет упрощенную процедуру ковалентной иммобилизации, по-сравнению с упомянутой в [5]. Далее к иммобилизованному на поверхности компакт-диска спейсеру ковалентно пришиваются зондовые молекулы с помощью фото-кросслинкера. Иммобилизация макромолекулярных зондов по этой схеме приводит к изменению поверхностного слоя диска и появлению ошибок считывания 1 рода при считывании устройством привода модифицированных таким образом молекулярными зондами лазерных компакт-дисков.

Эта схема имеет преимущество перед схемами модификации поверхности компакт-диска, используемыми в работе [6] и патенте [4], а именно схема имеет отличие в том, что не использует альдегидные группы на конце спейсера для иммобилизации зондов. Применение этого отличия:

а) расширяет возможности иммобилизации зондов к спейсеру за счет расширения класса веществ, не содержащих аминогруппы; в частности, для иммобилизации белков, у которых на поверхности не содержится аминогрупп, аптамеров, и других макромолекулярных соединений;

б) при использовании фото-кросслинкера может повышаться отношение количества иммобилизованных зондовых молекул на один спейсер, по сравнению со способом, предлагаемом в работе [6] и патенте [4], что приводит к повышению чувствительности диагностической тест-системы;

в) в предлагаемом в данном патенте способе в процедуре активации поверхности компакт-диска используются более экологически безопасные соединения, не включающие хлорорганические вещества; процедура активации поверхности компакт-диска более проста и состоит из меньшего количества стадий, при использовании тест-системы отказываются от использования дорогого двухлазерного плеера.

Зоны макромолекул инкубируются в объеме раствора биологической жидкости, например растворе сыворотки или плазмы крови, экстракте из тканевого материала и т.д. для увеличения количества вылавливаемых макромолекул, специфичных заболеваниям, зоны иммобилизации могут организовываться как дно трехмерных ячеек, вмещающих объем аналита биологической жидкости, и образовывать таким образом поля иммобилизации с ячейками, например, с иммобилизованными HCVcore Ag (антигенами вируса гепатита С) и ячейками с иммобилизованными молекулами антител к сывороточному амилоиду А (анти-SAA), в них образуются за счет специфичного вылавливания специфичные комплексы, например, иммобилизованные HCVcoreAg/анти-HCVcore и/или иммобилизованные анти-SAA/SAA. Такие комплексы изменяют коэффициент преломления света в поверхностном слое компакт-диска и приводят к появлению ошибок считывания 2 рода с более высоким уровнем, которые регистрируются с помощью устройства считывания лазерных компакт-дисков. После чего ошибки 1 и 2 рода сравниваются, и на основании сравнения ошибок 2 рода и ошибок 1 рода делается вывод о наличии маркеров заболевания в биологической жидкости в определенном секторе диска. Контроль изменения поверхности диска может осуществляться также по числу измененных данных, относящихся к конкретному физическому месту на компакт-диске, где иммобилизованы зондовые молекулы.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг.1 приведены схема компакт-диска с иммобилизованными HCVcoreAg и иммобилизованными антителами к сывороточному амилоиду А и общая схема устройства регистрации.

На фиг.2 показана схема определения количества ошибок чтения, возникающих из-за комплексообразования иммобилизованного на поверхности биочипа HCVcore с анти-HCVcore, присутствующем в сыворотке крови, получаемая с применением устройства привода считывания лазерных компакт-дисков. Соответствующие значения суммарных уровней ошибок чтения для секторов чтения приведены на фиг.2, А и 2, В в виде диаграмм.

HCVcoreAg/анти-HCVcore на поверхности компакт-диска по величине превышает уровень ошибок, когда на поверхности диска таких макромолекулярных комплексов нет.

На фиг.3 показана типичная схема увеличения уровня ошибок из-за комплексообразования иммобилизованных на поверхности биочипа антител к сывороточному амилоиду А с сывороточным амилоидом А, присутствующих в сыворотке крови. Соответствующие значения уровней ошибок для секторов чтения приведены на фиг.3, А и 3, В.

Как видно из сравнения фиг.3, В с 3, А, уровень ошибок считывания, характерный для иммобилизованных на поверхности биочипа антител (антисывороточный амилоид А), не связанных в комплекс с сывороточным амилоидом А при инкубации биочипа в крови, не содержащей сывороточный амилоид А, меньше уровня ошибок для биочипа с комплексами анти-амилоид А/сывороточный амилоид А, возникающих при инкубации биочипа в крови, содержащей сывороточный амилоид А.

Устройство по настоящему изобретению содержит компакт-диск 1, представленный на фиг.1, содержит измерительный компакт-диск - биочип, поверхность которого модифицирована с помощью азидных производных полем ковалентно иммобилизованных молекул, способных образовывать комплексы с макромолекулами, специфичными для инфекционных и соматических заболеваний (например, антигенов вируса гепатита С и антител к сывороточному амилоиду А).

Компакт-диск, используемый в предлагаемом способе на основе диагностической тест-системы, представленный на фиг.1, содержит измерительный компакт-диск - биочип, поверхность которого модифицирована молекулами, способными образовывать комплексы с макромолекулами, специфичными для заболеваний. Модификация проводится с помощью спейсера и фото-кросслинкеров поликарбонатной поверхности компакт-диска, при этом иммобилизуется один из партнеров взаимодействующей пары. Луч лазера устройства привода считывания лазерных компакт-дисков падает на границу компакт-диска. Проходящее внутрь слоя компакт-диска излучение отражается от отражающего слоя диска с нанесенным на нем в определенном порядке системы «pits» и «lands» и регистрируется приемником излучения в головке устройства привода считывания лазерных компакт-дисков. Анализ ошибок считывания или данных на поверхности компакт-диска с иммобилизованными молекулами без комплексов с макромолекулами, специфическими к заболеваниям, и с комплексами с макромолекулами, специфичными для заболеваний, выловленными из биологической жидкости, производится на том же компьютере, а также может производиться и на другом компьютере.

Таким образом, мониторинг изменения уровня ошибок в зависимости от содержания маркерных макромолекул, специфических для заболеваний, например антител к антигенам гепатита и/или амилоида в биологической жидкости, позволяет регистрировать эти маркеры заболевания в крови.

Так как количество ошибок считывания связано с количеством макромолекул на поверхности диска, то по величине увеличения количества ошибок можно определить количество образовавшихся комплексов, то есть количественно можно охарактеризовать концентрацию комплексов зонд-маркер заболевания.

В предлагаемом способе и диагностической тест-системе возможна иммобилизация на поверхности компакт-диска макромолекулярных зондов в виде не только антител и/или антигенов, а также в виде их фрагментов, пептидов и/или олигонуклеотидов, включая аптамеры, способных образовывать специфические комплексы с маркерами, связанными с соответствующими заболеваниями, в различных комбинациях.

В способе и диагностической тест-системе возможна регистрация одного, двух и более заболеваний одновременно, при иммобилизации одного, двух и более типов молекулярных зондов (антител, и/или антигенов, и/или фрагментов антител, и/или пептидов, и/или олигонуклеотидов, включая аптамеры), способных образовывать специфические комплексы с маркерами, связанными с соответствующими заболеваниями, в различных комбинациях.

В качестве компакт-дисков для создания диагностической системы могут использоваться CD-R, CD-RW и другие диски, поверхностная структура которых чувствительна к нанесению на нее биологических макромолекул при считывании посредством считывающих лазерных устройств, а в качестве биочипов - компакт-диски с иммобилизованными на их поверхности антител и/или антигенов, а также в виде их фрагментов, пептидов и/или олигонуклеотидов, включая аптамеры, способные образовывать специфические комплексы с маркерами, связанными с соответствующими заболеваниями, в различных комбинациях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Moshkovskii S.A., Serebryakova M.V., Kuteykin-Teplyakov K.B., Tikhonova O.V., Goufman E.I., Zgoda V.G., Taranets I.N., Makarov O.V., Archakov A.I. Proteomics. 2005 Sep;5(14):3790-3797.

2. Koval V.V., Gnedenko O.V., Ivanov Yu.D., Fedorova O.S., Archakov A.I., Knorre D.G. Real - time oligonucleotide hybridization kinetics monitored by resonant mirror technique. IUBMB LIFE, 1999, 48, 1-4.

3. Нанодиагностическая тест-система для выявления вируса гепатитов. Заявка N2004134192 (037195) от 24.11.2004.

4. La Clair J. J. Патент N 1189062 от 20.03.2002.

5. J. J. La Clair, M.D. Burkart Org. Biomol. Chem. 2003, 7, 3244-3249.

6. J. J. La Clair, M.D. Burkart Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 1-14.