Производные прегн-17(20)-ена, проявляющие противоопухолевую активность

Данное изобретение относится к области медицинской химии и фармакологии и касается новых производных прегн-17(20)-ена, замещенных в положении 21 азотсодержащими гетероциклами, которые проявляют противоопухолевую активность.

Рак предстательной железы является наиболее распространенным онкологическим заболеванием мужчин. Андрогены играют ключевую роль в развитии и прогрессии рака простаты, а снижение уровня андрогенов в опухоли лежит в основе современной стратегии терапии этого заболевания. Ключевым ферментом синтеза андрогенов является цитохром Р450 17А1 (17α-гидроксилаза-17,20-лиаза, CYP17A1). В настоящее время CYP17A1 рассматривается в качестве основной мишени для разработки лекарственных препаратов для лечения рака простаты.

Известны стероидные и нестероидные соединения, обладающие способностью ингибировать активность CYP17A1, подавлять рост клеток карциномы простаты и проявлять противоопухолевую активность in vivo. В качестве стероидных соединений, являющихся ингибиторами CYP17A1, используются 3-пиридил-, 2-пиридил, 4-пиридил-, 1-пиразолил-, 1-имидазолил-, 1,2,3-триазол-1-ил-, 1,2,3-триазол-2-ил-, 1,2,4-триазол-1-ил-, 1Н-бензимидазол-1-ил-содержащие производные андрост-16-ена [1-6].

Известен ингибитор CYP17A1 - андроста-5,16-диен-17-(3-пиридил)-3β-ол (абиратерон), являющийся лекарственным препаратом против рака простаты. Ацетат абиратерона (торговое название Zytiga) в 2011 г. был рекомендован к широкому применению в качестве лекарственного препарата, а его аналог, галетерон (андроста-5,16-диен-гидрокси-17-(1H-бензимидазол-1-ил)-3β-ол, TOK-001, VN/124-1) в настоящее время проходит III фазу клинических испытаний. Ингибирование абиратероном и галетероном активности CYP17A1 вызывает подавление биосинтеза андрогенов, замедляет рост опухолевых клеток простаты и развитие опухоли у мышей, а также продлевает жизнь больных, страдающих от осложненных форм рака простаты на последних стадиях болезни [7, 8].

Синтез абиратерона и галетерона сложен и дорог, поскольку: 1) осуществляется в пять стадий; 2) включает использование в качестве исходного сырья гормональный препарат дегидроэпиандростерон; 3) включает использование катализатора на основе палладия.

Описаны оксазолин-содержащие производные прегна-5,17(20)-диена [9, 10], однако сведений об их биологической активности ранее не приводилось.

Задачей настоящего изобретения является разработка новых средств, обладающих способностью ингибировать активность 17α-гидроксилазы-17,20-лиазы и подавлять рост клеток карциномы простаты.

В соответствии с изобретением описывается ингибитор активности 17α-гидроксилазы-17,20-лиазы (CYP17A1), подавляющий рост клеток карциномы простаты, представляющий собой производные прегн-17(20)-ена общей формулы (I), где R - 4',5'-дигидро-1',3'-оксазол-2'-ил- (Ia) либо бензо-[d]-оксазол-2'-ил (Ib). Описываемые соединения, а именно 2'-{[(E)-3β-гидроксиандрост-5-ен-17-илиден]-метил}-4',5'-дигидро-1',3'-оксазол Ia и 2'-{[(Е)-3β-гидроксиандрост-5-ен-17-илиден]-метил}-бензо-[d]-оксазол Ib, отличаются от известных соединений (андрост-16-енов, андроста-5,16-диенов) тем, что они содержат другие гетероциклические заместители в положении 21, являются другим классом стероидных соединений, у которых стероидный фрагмент относится к ряду прегнана, и двойная связь занимает положение 17(20).

Соединения Ia и Ib получены в индивидуальном состоянии (см. схему получения); структура охарактеризована методами ¹Н-ЯМР; ¹³С-ЯМР [на приборе АМХ-III (Bruker, 400 МГц в CDCl₃]; МСВР [на приборе Bruker 'Apex Ultra' FT ICR MS при положительной ионизации в режиме электроспрея]; изучение ингибирования соединениями Ia и Ib каталитической активности CYP17A1 проводили электрохимическим микрометодом; изучение влияния соединений Ia и Ib на рост и пролиферацию клеток карциномы простаты линии LNCaP проводили с использованием метода [11].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Способ получения 2'-{[(E)-3β-гидроксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-4',5'-дигидро-1',3'-оксазола (соединения формулы (Ia), где R=4',5'-дигидро-1',3'-оксазол-2'-ил).

а) К раствору 17α-бром-21-иод-3β-ацетоксипрегн-5-ен-20-она (563 мг, 1.0 ммоль) в 20 мл кипящего абс. CH₃CN добавляли этаноламин (300 мкл, 5.0 ммоль), смесь кипятили при перемешивании 20 мин, растворитель упаривали, остаток растворяли в 30 мл CHCl₃. Хлороформный раствор последовательно промывали 3%-ным водным раствором HCl (10 мл), нас. раствором NaHCO₃ (10 мл), водой (10 мл), сушили над Na₂SO₄, упаривали, остаток разделяли колоночной хроматографией на силикагеле в системе петролейный эфир - EtOAc (1:1). После упаривания растворителя получали смесь [17(20)Z]- и [17(20)Е]-3β-ацетокси-21-[(1-гидроксиэтил)-2-амино]-21-оксопрегна-5,17(20)-диенов в соотношении 1:1. МСВР, рассчитано для [C₂₅H₃₈NO₄]⁺: 416.2801; найдено: 416.2803. ¹Н ЯМР: 082 (3Н, с, Н-18 в Е-изомере); 1.02 (3Н, с Н-18 и Н-19 в Z-изомере); 1.04 (3Н, с, Н-19 в Е-изомере); 2.02 (3Н, с, Ас); 2.50-2.66 (1Н, м, Н-16 в Z-изомере); 2.88 (2Н, м, Н-16 в Е-изомере); 3.42 и 3.73 (каждый 4Н, м, NCH₂ и ОСН₂ в обоих изомерах); 4.60 (2Н, м, Н-3 в обоих изомерах); 5.38 (2Н, м, Н-6 в обоих изомерах); 5.44 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20 в Е-изомере); 5.63 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20 в Z-изомере); 5.82 (2Н, уш, CONH в обоих изомерах);

б) 2М Раствор CCl₄ в абс. CH₃CN (2.5 мл) при перемешивании добавляли к суспензии Ph₃P (524 мг, 2.0 ммоль) в 10 мл абс. CH₃CN при +2°C, затем прибавляли смесь [17(20)Z]- и [17(20)Е]-3β-ацетокси-21-[(1-гидроксиэтил)-2-амино]-21-оксопрегна-5,17(20)-диенов (232 мг, 0.5 ммоль) и 2М раствор Et₃N в абс. CH₃CN (0.85 мл), затем удаляли охлаждение и смесь перемешивали 2 ч. Смесь разбавляли CHCl₃ (30 мл), промывали насыщенным раствором K₂CO₃ (10 мл), насыщенным раствором Na₂SO₄ (10 мл), сушили над Na₂SO₄ и упаривали. Продукт выделяли колоночной хроматографией на силикагеле в системе гексан-ацетон-АсОН (30:19:1) и дополнительно очищали препаративной ТСХ в той же системе. 2'-{[(E)-3β-Ацетоксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-4',5'-дигидро-1',3'-оксазол (138 мг, 0.31 ммоль, 62%) был выделен в виде белой пленки. МСВР, рассчитано для [C₂₅H₃₆NO₃]⁺: 398.5582; найдено: 398.5588; ¹Н ЯМР: 083 (3Н, с, Н-18); 1.03 (3Н, с, Н-19); 2.02 (3Н, с, Ас); 2.74 (2Н, м, Н-16); 3.89 (2Н, м, Н-5'); 4.22 (2Н, м, Н-4'); 4.59 (1Н, м, Н-3); 5.38 (1Н, м, Н-6); 5.66 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20); ¹³С ЯМР: 18.35; 19.40; 21.14; 21.47; 24.65; 27.85; 28.52; 29.78; 30.30; 31.70; 35.35; 35.81; 37.48; 38.29; 42.95; 50.29; 53.99; 68.50; 71.28; 104.96; 121.33; 128.24; 130.86; 140.94; 170.02;

в) 2'-{[(Е)-3β-Ацетоксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-4',5'-дигидро-1',3'-оксазол (40 мг, 0.1 ммоль) кипятили с 200 мг K₂CO₃ в смеси 1 мл МеОН и 0,6 мл воды 30 мин. Затем к смеси добавляли CHCl₃ (10 мл) и воду (3 мл), хлороформный экстракт отделяли, промывали нас. раствором Na₂SO₄, сушили над Na₂SO₄ и упаривали. 2'-{[(E)-3β-Гидроксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-4',5'-дигидро-1',3'-оксазол выделяли препаративной ТСХ в системе гексан-ацетон (3:2). Получено (32 мг, моль, 90%) белого порошка; МСВР, рассчитано для [C₂₃H₃₄NO₂]⁺: 356.2590; найдено: 356.2601; ¹Н ЯМР: 0.83 (3Н, с, Н-18); 1.02 (3Н, с, Н-19); 2.74 (2Н, м, Н-16); 3.51 (1H, м, Н-3); 3.88 (2Н, м, Н-5'); 4.22 (2Н, м, Н-4'); 5.36 (1Н, м, Н-6); 5.61 (1H, т, J=2 Гц, Н-20); ¹³С ЯМР: 18.36; 19.47; 21.10; 23.06; 23.88; 24.67; 29.03; 29.74; 30.29; 31.76; 35.47; 37.42; 38.87; 42.39; 50.41; 54.17; 68.27; 71.72; 105.25; 121.42; 128.90; 130.94; 140.96.

Пример 2. Способ получения 2'-{[(Е)-3β-гидроксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-бензо-[d]-оксазола) (соединения формулы (Ib), где R = бензо-[d]-оксазол-2'-ил).

а) Смесь 17α-бром-21-иод-3β-ацетоксипрегн-5-ен-20-она (563 мг, 1.0 ммоль), 2-аминофенола (218 мг, 2.0 ммоль), t-BuOK (224 мг, 2.0 ммоль), t-BuOH (2 мл) и сухого диоксана (10 мл) кипятили при перемешивании 20 мин, охлаждали, нейтрализовали добавлением АсОН, добавляли 10 мл воды и 30 мл CHCl₃, хлороформный раствор промывали насыщенным раствором Na₂SO₄ (10 мл), сушили над Na₂SO₄, упаривали, остаток разделяли колоночной хроматографией на силикагеле в системе гексан-ацетон-АсОН (30:19:1). После упаривания растворителя получали смесь [17(20)Z]- и [17(20)Е]-3β-ацетокси-21-[(2-гидроксифенил)-2-амино]-21-оксопрегна-5,17(20)-диенов в соотношении 1:1 в виде сухой темно-оранжевой пленки. Выход: 370 мг (0.80 ммоль, 80%); МСВР, рассчитано для [C₂₉H₃₈NO₄]⁺: 464.2801; найдено: 464.2793; ¹H ЯМР: 0.87 (3Н, с, Н-18 в E-изомере); 1.02 (3Н, с, Н-18 в Z-изомере); 1.05 (3Н, s, H-19 в Z-изомере); 1.07 (3Н, s, H-19 в Е-изомере); 2.02 (3Н, с, Ас в Z-изомере); 2.03 (3Н, с, Ас в E-изомере); 2.65 (1Н, м, Н-16 в Z-изомере); 2.96 (2Н, м, Н-16 в Е-изомере); 4.60 (2Н, м, Н-3 в обоих изомерах); 5.38 (2Н, м, Н-6 в обоих изомерах) 5.68 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20 в Е-изомере); 5.83 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20 в Z-изомере); 6.78-7.14 (8Н, м, арил в обоих изомерах); 7.45 (1Н, уш. с, CONH в Z-изомере); 7.48 (1Н, уш. с, CONH в Е-изомере);

б) 2М Раствор CCl₄ в абс. CH₃CN (2.5 мл) при перемешивании добавляли к суспензии Ph₃P (524 мг, 2.0 ммоль) в 10 мл абс. CH₃CN при +2°C, затем прибавляли смесь [17(20)Z]- и [17(20)Е]-3β-ацетокси-21-[(2-гидроксифенил)-2-амино]-21-оксопрегна-5,17(20)-диенов (232 мг, 0.5 ммоль) и 2М раствор Et₃N в абс. CH₃CN (0.85 мл), затем удаляли охлаждение и смесь перемешивали 2 ч. Смесь разбавляли CHCl₃ (30 мл), промывали насыщенным раствором K₂CO₃ (10 мл), насыщенным раствором Na₂SO₄ (10 мл), сушили над Na₂SO₄ и упаривали. 2'-{[(Е)-3β-ацетоксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-бензо-[(1]-оксазол выделяли колоночной хроматографией на силикагеле в системе гексан-ацетон-АсОН (30:19:1) и дополнительно очищали препаративной ТСХ в той же системе. МСВР, рассчитано для [C₂₉H₃₆NO₃]⁺: 446.2695; найдено: 446.2691. ¹Н ЯМР: 0.91 (3Н, с, Н-18); 1.06 (3Н, с, Н-19); 2.02 (3Н, с, Ас); 3.01 (2Н, м, Н-16); 4.60 (1Н, м, Н-3); 5.38 (1Н, м, Н-6); 6.17 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20); 7.47 и 7.65 (каждый 2Н, м, арил). ¹³С ЯМР: 18.58; 19.52; 21.13; 21.56; 24.83; 27.91; 31.11; 31.16; 31.86; 35.42; 36.91; 37.07; 37.16; 38.27; 50.32; 54.25; 58.59; 74.00; 104.54; 110.38; 122.39; 124.32; 124.64; 124.74; 125.52; 139.99; 150.22; 163.95; 170.70;

в) Смесь 2'-{[(Е)-3β-ацетоксиандрост-5-ен-17-илиден]метил}-бензо-[d]-оксазола (90 мг, 0.2 ммоль), МеОН (4 мл), диоксана (4 мл) и 2М NaOH (1 мл) перемешивали 30 мин, нейтрализовали добавлением АсОН, обрабатывали 20 мл CHCl₃ и 6 мл воды, хлороформный экстракт промывали насыщенным раствором Na₂SO₄ (10 мл), сушили над Na₂SO₄ и упаривали. 2'-{[(Ε)-3β-Гидроксиандрост-5-ен-17-иден]метил}-бензо-[d]-оксазол выделяли препаративной ТСХ в системе гексан - EtOAc (1:1) в виде светло-желтой сухой пленки. Выход 76 мг (0.19 ммоль, 95%); МСВР, рассчитано для [C₂₇H₃₄NO₂]⁺: 404.2584; найдено: 404.2583. ¹H ЯМР: 0.92 (3Н, с, Н-18); 1.05 (3Н, с, Н-19); 3.01 (2Н, м, Н-16); 3.52 (1H, м, Н-3); 5.36 (1H, м, Н-6); 6.17 (1Н, т, J=2.0 Гц, Н-20); 7.46 и 7.67 (каждый 2Н, м, арил). ¹³С ЯМР: 18.49; 19.53; 21.11; 24.09; 24.75; 31.04; 34.09; 34.24; 35.39; 36.74; 37.24; 37.35; 46.49; 50.36; 56.78; 71.75; 104.41; 110.34; 119.41; 119.66; 121.36; 124.35; 124.58; 124.65; 141.02; 150.17; 163.89.

Пример 3. Ингибирование активности 17а-гидроксилазы-17,20-лиазы (CYP17A1) соединениями формулы (I)

Исследование ингибирования каталитической активности CYP17A1 соединениями формулы (I) в сравнении с абиратероном проводилось электрохимическим микрометодом с использованием препарата CYP17A1, иммобилизованного на наноструктурированном электроде. Для приготовления ферментных электродов на поверхность рабочего графитового электрода наносили 1 мкл 0,1 M DDAB в хлороформе, после испарения хлороформа (10 мин) наносили 1 мкл 1,8 мкМ CYP17A1. Ферментные электроды оставляли на 12 часов при +4°C во влажной камере, предотвращающей полное высыхание электродов. Эксперименты выполнялись с помощью потенциостата AUTOLAB PGSTAT12 ("Eco Chemie", Нидерланды), снабженного программным обеспечением GPES. Все измерения выполнялись при комнатной температуре в 1 мл 0,1 M калий-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,05 M NaCl и 0,04% Тритон Χ-100.

Цикловольтамперограммы регистрировали при скорости развертки потенциала 50 мВ/с, в аэробных и анаэробных (при насыщении аргоном) условиях. Хроноамперометрические измерения проводили в 1 мл 0,1 M калий-фосфатного буфера, содержащего 0,05 M NaCl и 0,04% Тритон Х-100, рН 7,4, при фиксированном потенциале рабочего электрода -0,5 В и постоянном перемешивании. Титрование проводили этанольным раствором прегненолона (3:1, по объему) после выхода амперометрической кривой на стационарное значение тока; концентрация прегненолона в электрохимической ячейке варьировала от 10 до 450 мкМ. Значения IC₅₀ (концентрации вещества при котором каталитическая активность уменьшалась вдвое) для изучаемых соединений рассчитывали по снижению максимального каталитического тока CYP17A1 при хроноамперометрическом титровании раствором прегненолона. Значения IC₅₀ для соединений Ia, Ib и абиратерона составляли 0.9 (±0.1) мкМ, 110 (±15) мкМ и 1,3±0,1 мкМ, соответственно.

Пример 4. Ингибирование роста клеток карциномы простаты линии LNCaP соединениями формулы (I)

Клетки карциномы простаты линии LNCaP, полученные из АТСС культивировали в среде RPMI 1640 в присутствии 10% эмбриональной сыворотки теленка и 5% раствора антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Клетки высаживали в 96-ячеечный планшет (Corning, Inc.) с плотностью 2500 клеток/лунку и оставляли на 24 ч. Затем среду заменяли на свежую, содержащую соединения Ia и Ib в концентрациях (0.5 мкМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 6 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ, 50 мкМ. Клетки растили в присутствии исследуемых соединений в течение 96 ч, затем в каждую лунку добавляли МТТ-реагент [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (125 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл в фосфатном буфере), выдерживали 4 ч при 37°C, затем в каждую лунку добавляли 125 мкл 0.1 M раствора HCl в iPrOH, содержащем 10% Тритон X 100 и планшет оставляли на ночь при комнатной температуре, а затем в каждой лунке измеряли оптическое поглощение при 630 нм на приборе "LKB microplate reader". Значения каждой точки рассчитывали из шести измерений, все эксперименты проводились трижды, значения GI₅₀ (концентрация вещества, вызывающая подавление роста клеток вдвое) рассчитывались графически. Дозовые кривые приведены на рисунке 1. Значения GI₅₀ для соединений Ia и Ib составляли 4,7 мкМ и 19,3 мкМ, соответственно.

ЛИТЕРАТУРА

1. Njar VCO, Brodie АМН. Inhibitors of 17R-hydroxylase-C17,20-lyase (CYP17): Potential agents for the treatment of prostate cancer. Curr Pharm Des 1999, 5: 163-180.

2. Bruno RD, Njar VCO. Targeting cytochrome P450 enzymes: A new approach in anti-cancer drug development. Bioorgan Med Chem 2007; 15: 5047-5060.

3. Baston Ε, Leroux F.R. Inhibitors of Steroidal Cytochrome P450 Enzymes as Targets for Drug Development. Recent Pat Anti-Cancer Drug Disc. 2007, 2: 31-58.

4. Ling Y, Li J, Liu Y, Kato K, Klus GT, Brodie A. 17-Imidazolyl, pyrozolyl, isoxaloly androstatene derivatives. Novel steroidal inhibitors of human cytochrome C17,20-lyase (P45017R). J. Med Chem. 1997, 40: 3297-3304.

5. Njar VCO, Kato K, Nnane IP, Grigoryev DN, Long В J, Brodie АМН. Novel 17-azolyl steroids; potent inhibitors of cytochrome P450 17Rhydroxylase/17,20-lyase (P45017R): Potential agents for the treatment of prostate cancer. J. Med. Chem. 1998, 41: 902-912.

6. Potter GA, Barrie SE, Jarman M, Rowlands MG. Novel steroidal inhibitors of human cytochrome P450(17R) (17Rhydroxylase-C17,20-lyase): potential agents for the treatment of prostate cancer. J. Med. Chem. 1995, 38: 2463-2471.

7. US 5604213 A.

8. Stulov SV, Tkachev YV, Novikov RA, Zavialova MG, Timofeev VP, Misharin AY. Synthesis of 21-nitrogen substituted pregna-5,17(20)-dienes from pregnenolone, Steroids 2012; 77: 77-84.

9. Stulov SV, Mankevich OV, Novikov RA, Tkachev YV, Timofeev VP, Dugin NO, Pozdnev VF, Fedyushkina IV, Scherbinin DS, Veselovsky AV, Misharin AY. Synthesis and molecular modeling of (4''R)- and (4''S)-4''-substituted 2''-{[(E)-androst-5-en-17-ylidene]-methyl}-oxazolines. Steroids 2013; 78: 521-527.

10. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Meth. 1983, 65, 55-63.

Схема синтеза соединений Ia и Ib

а - H₂N(CH₂)₂OH/CH₃CN, Δ, 20 мин; b - H₂N(C₆H₄)OH, tBuOK/диоксан, tBuOH, Δ, 20 мин; с - Ph₃P, CCl₄; (CH₃CH₂)₃N/CH₃CN, +2о - 20°C, 2 ч; d - K₂CO₃/МеОН-H₂O, Δ, 20 мин; е - NaOH/диоксан, МеОН, H₂O, 20°C, 30 мин.