Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ MICROBACTERIUM PARAOXYDANS BKM AC-2619D - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм бактерий Microbacterium paraoxydans ВКМ Ас-2619D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C.

Уровень техники.

Известен штамм Microbacterium testaceum 17В (1. Патент RU №2475533. Штамм бактерий Microbacterium testaceum 17В - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы. C1, C12N 1/20, C12N 9/14. Заявка: 12.12. 2011. Опубликовано: 20.02.2013. Авторы: Чернухин В.А., Килёва Е.В., Голикова Л.Н., Болтенгаген А.А., Тарасова Г.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Патентообладатель: Общество с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм»), используемый для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей ДНК, способный расти при температуре от +8 до +37°C.

Недостатком известного штамма бактерий является не изученность окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.

Известны штаммы: Mycobacterium flavescens ЕХ-91 (2. Патент RU №2053296. Штамм Mycobacterium flavescens, используемый для очистки воды и почвы от нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12R1:32, C12N 1/20. Заявка: 92005971/13, 11.11.1992. Опубликовано: 27.01.1996. Бюл. №3. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Короткий Л.М. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии); Pseudomonas putida 36 (3. Авторское свидетельство СССР N1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. А1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.); Serratia odorifera А 36 (4. Патент RU №2157839. Штамм бактерий Serratia odorifera А 36 ГКМ ВИЗР N 100 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, B09C 1/10 C12N 1/26, C12R1:425. Заявка: 99111625/13, 31.05.1999. Опубликовано: 20.10.2000. Патентообладатели: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К. Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И., Чумакова А.Я., Сабаляускас Ю., Диджяпетрис А., Янкявичус К.); Kurthia zopfii 7-204 (5. Патент RU №2270063. Штамм бактерий Kurthia zopfii, обладающий свойством утилизировать нефть, нефтепродукты и ароматические полициклические углеводороды. С2, В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/01. Заявка: 2003106326/13, 07.03.2003. Опубликовано: 20.01.2005. Патентообладатель: ООО ПКФ "БИГОР". Авторы: Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Щеблыкин И.Н., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Гайтан В.И., Лобов Ю.А., Стехновская Л.Д., Разживин А.В., Барбот B.C., Васильев В.Н.), обладающие эффективностью утилизировать нефть и нефтепродукты.

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м³ (6. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°C, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (от +8°C).

Известен нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliguefaciens, Micrococcus varians (7. Архипченко И.А., Загвоздкин В.К. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью препаратов на основе микробных удобрений // Экология и промышленность России. Спецвапуск. 2004. С. 16-18).

Недостатком является то, что нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов не достаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Колыма 7/2 (8. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +8 до +37°C.

В качестве прототипа служат штаммы: Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 (9. Патент RU 2482179. Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/57. Заявка №2012114907/10 от 04.2012 г. Опубликовано 20.05.2013 г. Бюллетень №14. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН) и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 (10. Патент РФ №2525930. Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07. Заявка: 2013113813/10, 27.03.2013. Дата подачи заявки: 27.03.2013. Опубликовано: 20.04.14 г. Бюл. №11. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН), обладающие высокой утилизирующей эффективностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Недостатком известных штаммов является то, что для наращивания биомассы из клеток штаммов Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 требуется специальная среда с добавлением перфторуглеродов в виде дефицитного и дорогостоящего препарата «Перфторан», что не экономично и усложняет процедуру накопления клеточной биомассы штаммов, используемых для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, кроме того, не известна их способность утилизировать бензин и керосин авиационный.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению, как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, которые могут быть использованы для очистки воды и почвы, как от нефти, так и от нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Поставленная задача решена тем, что получен новый бактериальный штамм бактерий Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, в относительно короткие сроки (7-60 суток).

Заявляемый штамм бактерий Microbacterium paraoxydans ВКМ Ас-2619D (авторский номер ELA-10м), выделен из пробы почвенно-гравийной смеси, загрязненной маслом моторным, отобранной с территории ОАО «Якутскэнерго», Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D.

Полученный штамм Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные неподвижные палочки.

Кулътуральные характеристики.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует матовые, непрозрачные, серовато-желтые колонии, диаметром 1-2 мм.

На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза - 40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует матовые, непрозрачные, серовато-желтые колонии, диаметром 1-2 мм.

На агаризованной среде Мюнца (11. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, формирует матовые, непрозрачные, серовато-желтые колонии, диаметром 1-2 мм.

В мясо-пептонном бульоне промышленного производства образует равномерную муть.

Растет в диапазоне pH 56,5-9,0.

Растет в диапазоне температур от +8 до +37±1°C.

Отношение к кислороду: аэробы.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-положительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, сероводород не продуцирует, не активный в отношении инозита, уреаза-отрицательный, тест с - отрицательный.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Результаты определения родовой принадлежности штаммов и процента сходства с ближайшими известными видами, представлены в таблице №1.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°C.

Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D

Штамм бактерий Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D из почвенно-гравийной смеси, загрязненной маслом моторным, методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого, соблюдая правила асептики, 1 г измельченной и предварительно просеянной почвенно-гравийной смеси, растирают в ступке и вносят в колбы емкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной средой следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, pH 7,2; в качестве источника углерода и энергии используют нефть, которую вносят в среду в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубация проводится в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C.

Рост бактерий наблюдают через 7 суток инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+8, +20, +30 и +37 (±1)°C).

Через 72 ч., при культивировании штамма при температурах от +8 до +37°C, на поверхности МПА наблюдали появление матовых, серовато-желтых колоний округлой формы диаметром 1-2 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpРНК и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (12. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.) идентифицированы, как штамм Microbacterium paraoxydans.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48-72 часов при температуре +20±1°C. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48-72 часов, при температуре плюс 20±1°C, при 200 об/мин.

Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D Ac-2625D с титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D

Клетки штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов).

Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.

Опыт проводят в трех повторностях.

Колбы культивируют при температурах +8°C; +20°C; +30°C; +37°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-0,25» (13. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Microbacterium paraoxydans ВКМ Ас-2619D на 7-е сутки культивирования в условиях постоянной аэрации утилизирует от 14,0 до 15,0% - нефти и нефтепродуктов при температуре +8°C; от 47,8 до 48,0% - при температуре +20°C; от 57,98 до 58,38% - при температуре +30°C; от 68,56 до 69,19% - при температуре +37°C (таблица 2).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти (нефтепродукта) и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ас-2619D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10⁹ клеток/см³ суспензии.

В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти (нефтепродукта) и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°C.

Полученные результаты (таблица 3) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Microbacterium paraoxydans ВКМ Ас-2619D за 60 суток составила 72,52% для нефти и 72,92% для дизельного топлива. Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, который может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).