Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA PLYMUTHICA -ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Аналоги изобретения

Известны штаммы: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Авторское свидетельство SU № 1493666. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. A1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:01, C12R 1:27, C02F 3/34, C02F 101:32, C02F 103:06. Заявка: 4280617, 09.07.1987. Опубликовано: 15.07.1989. Заявители: Киевский технологический институт пищевой промышленности, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.. Заболотного. Авторы: Клюшникова Т.М., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С.), Flavobacterium tirrennicum (2. Авторское свидетельство SU № 1409594, 1988 г. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. A1 C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R1:20, C02F 3/34, C02F 101:32. Заявка: 4066152, 24.03.1986. Опубликовано: 15.07.1988. Заявитель: Институт микробиологии и вирусологии АН КАЗССР. Авторы: Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известен штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (3. Патент RU N 2019527. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений. С1, C02F 3/34, Е02В 15/04, С09K 17/00. Заявка: 93017464/26, 30.04.1993. Опубликовано: 15.09.1994. Заявитель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр. Авторы: Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Патентообладатель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Известны штаммы Pseudomonas putida 36 (4. Авторское свидетельство СССР № 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), Acinetobacter sp. JN-2 (5. Патент RU N 2064017. Штамм бактерий Acinetobacter species ВКПМ В-5971, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 93009595/13, 23.02.1993. Опубликовано: 20.07.1996. Заявители: Ушков С.Б., Ильинская Н.В. Авторы: Ушков С.Б., Ильинская Н.В. Патентообладатели: Ушков С.Б., Ильинская Н.В.); Pseudomonas alcaligenes Е7 (6. Патент RU № 2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробиологии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.Н., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробиологии) и Pseudomonas alcaligenes В-1 (7. Патент RU № 2133770. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes B-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. С1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 98105709/13, 25.03.1998. Опубликовано: 27.07.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробиологии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробиологии). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах, что не эффективно в районах с холодным климатом.

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (8. Патент RU 2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве и не способен осуществлять очистку воды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +4 до +30°С.

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C, который может быть использован для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Предлагаемый штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9 VKМ В-2819D выделен из почвогрунтов, загрязненных арктическим дизельным топливом на территории Дизельной электростанции с. Чалчылган, Амгинский район, Республика Саха (Якутия). Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером VKMB-2819D.

Штамм Serratia plymuthica ELA-9 VKМ В-2819D утилизирует нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в качестве единственного источника углерода. Процесс идет в широком диапазоне температур (+4+30°C).

Использование штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D в естественных условиях, для очистки мерзлотной почвы от нефти, при средней температуре почвы от +8 до +14°C, позволяет достичь 56,98% деструкции нефти за 1 вегетационный период.

Деструкция нефти и нефтепродуктов в воде при температуре воды +20°C составляет 59,25 % за 2 месяца.

Деструкция нефти и нефтепродуктов в водной среде с добавлением минеральных компонентов предлагаемым штаммом на 5-е сутки культивирования при температуре +20+30°C составляет 48,78-60,2% - для нефти; 49,6-58,34% - для дизельного топлива; 48,74-57,72% - для масла моторного; 65,40-68,8% - для масла гидравлического; 57,77-65,52% - для газового конденсата; на 14 сутки культивирования при температуре +4°C штамм Serratia plymuthica ELA-9 VKМ В-2819D утилизирует 20,06% - нефти; 25,60% - дизельного топлива; 27,15% - масла моторного; 31,00% - масла гидравлического; 31,8% - газового конденсата.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: грамотрицательные, палочковидные, перитрихиальные, аспорогенные, хемороганотрофные, факультативно-анаэробные бактерии.

Культуральные признаки.

Растет при температуре +4+25±1°C, оптимум роста +4+15±°C в аэробных условиях, но может расти при температуре +30°C и в анаэробных условиях, однако теряет пигмент.

На мясопептонном агаре (ΜΠΑ) (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2, формирует влажные от малинового до оранжевого цвета колонии диаметром 1-3 мм.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует пастообразные матовые, от малинового до оранжевого цвета колонии диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3, формирует сметанообразные колонии оранжевато-малинового цвета, диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне (масс. %): ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2, вызывает диффузное помутнение с диффунгированием малинового пигмента в бульон.

На минеральной среде Мюнца (9. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (масс. %) ΚΝO₃ - 0,4; MgSO₄·7Η₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРO₄ - 0,14; KН₂РO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, растет в виде пастообразных малиновых колоний диаметром 1-3 мм.

Биохимические признаки.

Оксидазаположительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Активен в отношении инозита. Уреазаположителен. Тест с β-галактозидазой - положительный. Ферментирует сахарозу, маннит, сорбит, мальтозу. Не ферментирует лактозу, ацетат натрия, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.

Устойчив к каотиму, амоксициллину, пефлоксацину, амоксиклаву, левомицетину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу, амосину. Слабоустойчив к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, ампициллину.

При секвенировании вариабельных участков 16SpPHK получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков 16SpPHK тестируемый штамм отнесен к виду Serratia plymuthica.

Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм наиболее близок к виду Serratia plymuthica (99,77%).

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).

Условия хранения:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°C.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном ΜΠΑ.

Пример 1. Культивирование штамма Serratia ptymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Предлагаемый штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D выделен из почвогрунтов, загрязненных арктическим дизельным топливом на территории Дизельной электростанции с. Чапчылган, Амгинский район, Республика Саха (Якутия).

Культивирование штамма проводили в минеральной среде Мюнца следующего состава (г/дм³): ΚΝO₃ - 4,0; MgSO₄·7Η₂Ο-0,8; NaCl - 1,0; K₂НРO₄- 1,4; KН₂РO₄ - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³; pH среды - 7,2. Для чего 1,0 г нефтезагрязненной почвы с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 72 часа инкубации по образованию мутной розоватой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти. Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар). Далее посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при +4+15+20+30°C. Через 48 часов на поверхности ГРМ-агара появились сметанообразные колонии малинового цвета, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (10. Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.) идентифицированы как штамм Serratia plymuthica.

Изолированные колонии пересевали на скошенный мясопептонный агар. Через 48 часов инкубации при температуре +20°C клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного агара использовали для определения активности в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности штамма бактерий Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного мясо-пептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D культивируют в минеральной среде Мюнца, состав которой описан в примере 1.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин, при температурах +4°C; +20°C; +30°C в течение 5 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (11.ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»; 12.РД 39-0147098-90 Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 5-е сутки при температуре +20+30°C утилизирует 48,78-60,2% - нефти; 49,6-58,34% - дизельного топлива; 48,74-57,72% - масла моторного; 65,40-68,8% - масла гидравлического; 57,77-65,52% - газового конденсата; на 14 сутки при температуре +4°C утилизирует 20,06% - нефти; 25,60% - дизельного топлива; 27,15% - масла моторного; 31,00% - масла гидравлического; 31,8% - газового конденсата (таблица 1).

Пример 3. Приготовление препарата на основе клеток штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D

Клетки штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D со скошенного мясо-пептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

В стерильных условиях в 100,0 см³ минеральной среды Мюнца (по примеру 1) 10,0 см³ суспензии бактериального изолята. Культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов, при температуре 20±1°C. Получают жидкую мутноватую эмульсию малинового оттенка, с титром не менее 1 млрд клеток/см³, которую используют как препарат для обработки почвы или воды от загрязнений нефтью.

Пример 4. Применение препарата на основе клеток штамма Serratia plymuthica ELA-9 VKM B-2819D для очистки почвы от нефтезагрязнения

Способность штамма Serratia plymuthica VKM B-2819D активировать процессы деградации нефтезагрязнений в почве показаны в условиях полевого опыта. Препарат, полученный по примеру 3, вносят в количестве 1 литра на 10 кг нефтезагрязненного субстрата. Почву перемешивают и экспонируют в течение 1 вегетационного периода (2,5 месяца) (таблица 2).

За один вегетационный период деградация нефтезагрязнений на опытных участках, обработанных бактериальной суспензией, составляла при использовании штамма: Serratia plymuthica VKM B-2819D - 56,98%; в контрольной почве, не обработанной бактериальной суспензией, естественные потери нефтезагрязнения составили - 11,5%.

Пример 5. Очистка воды от нефти с помощью препарата на основе клеток штамма Serratia plymuthica VKM B-2819D

В эксикатор объемом 5,0 дм³, вносили 3,0 дм³ воды и 30,0 см³ препарата на основе штамма бактерий Serratia plymuthica VKM B-2819D, полученного вышеописанным способом (пример 3). Для создания нефтяной пленки, в емкости добавляли 30000 мг сырой неочищенной нефти. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микроорганизмов.

Эксперименты проводились в течение 2-х месяцев при температуре воды +20±1°C.

Биодеградацию нефти определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025».

Установлено, что деструкция нефти в воде за 2 месяца составила 59,25%. Деструкция в контрольной емкости за 2 месяца существенно не изменилась (таблица 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма Serratia plymuthica VKM B-2819D является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C, который может быть использован как для очистки почв, так и для очистки воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).