Штамм бактерий Bacillus subtilis - деструктор нефти и нефтепродуктов

Штамм бактерий Bacillus subtilis – деструктор нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм Bacillus subtilis СНБС-1 – деструктор нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

В настоящее время загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами является одной из актуальных проблем. Ежегодно в России происходит в среднем около 20 тысяч инцидентов, связанных с попаданием нефти и нефтепродуктов в почвы и открытые водоемы. При масштабных разливах загрязнения распространяются на сопредельные территории, в результате нарушенные земли на долгие годы выводятся из хозяйственного оборота. Из многочисленных методов, которые позволяют сократить сроки реабилитации нефтезагрязненных почв, наиболее оправданными и экологичными считаются биологические способы, основанные на интенсификации микробиологической деструкции нефтяных углеводородов (см. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В. и др. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология, 1997. Т.33. №2. – С.198-201).

Хорошую эффективность в очистке почв от нефти и нефтепродуктов оказывает консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас.% каждого микроорганизма (см. RU № 2191643, МПК B09C1/10, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:01, опубл. 27.10.2002).

Недостатком известного решения является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18…+22ºС, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+5ºС).

Известны штаммы: Acinetronacter sp. HB-1 (см. RU № 2077579, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12R1:01, C12N1/20, B09C101:00, опубл. 20.04.1997); Pseudomonas putida 36 (см. SU № 1076446, МПК C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20 C02F3/34, C02F101:32, C12N1/20, C12R1:40, опубл. 28.02.1984); Pseudomonas alcaligenes E7 (см. RU № 2134723, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20, C12R1:38, опубл. 20.08.1999).

Недостатком известных штаммов является то, что они также утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliguefaciens, Micrococcus varians (см. Архипченко И.А., Загвоздкин В.К. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью препаратов на основе микробных удобрений // Экология и промышленность России. Спецвыпуск. 2004. С. 16-18).

Недостатком является то, что нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов не достаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биоочистки сточных вод (см. KZ № 27045, МПК C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/125, опубл. 14.06.2013). Штамм бактерий эффективен для очистки сточных вод, активно расщепляет животные жиры.

Недостатком известного штамма бактерий является неизученность окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.

Известны штаммы: Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 (см. RU №2482179, МПК C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/57, опубл. 20.05.2013) и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 (см. RU №2525930, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07, опубл. 20.04.14), обладающие высокой утилизирующей эффективностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Недостатком известных штаммов является то, что они не могут развиваться и утилизировать нефть и нефтепродукты при температурах +5 и +40°С, а также то, что для наращивания биомассы из клеток штаммов Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 требуется специальная среда с добавлением перфторуглеродов в виде дефицитного и дорогостоящего препарата «Перфторан», что не экономично и усложняет процедуру накопления клеточной биомассы штаммов, используемых для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов.

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (см. RU №2446900, МПК В09С 1/10, опубл. 10.04.2012), обладающий способностью снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Недостатком изобретения является то, что штамм осуществляет деградацию только нефти, притом только в почве, и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +5 до +40°С.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +5 до +40°С, который может быть использован как для очистки воды, так и для очистки почвы как от нефти, так и от нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Bacillus subtilis СНБС-1 - деструктор нефти и нефтепродуктов, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), перспективный как для очистки почв, так и для очистки воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в широком диапазоне температур (от +5 до +40°С), в относительно короткие сроки (3-45 суток).

Заявляемый штамм бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 выделен 16 февраля 2015 года из мерзлых почвенных образцов, загрязненных дизельным топливом (соляркой), отобранных возле емкостей Момского РЭС ОАО «Сахаэнерго», Северо-Восток Якутии, Момский район, село Хонуу.

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП «ГосНИИгенетика», 117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, регистрационный номер ВКПМ В-12239.

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus, причем гомология с некоторыми видами рода Bacillus составляет 99%.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

CTTCTGCMTCAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTYGCCTTGGTGAGCCRTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT

Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы RDB II, предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представлены в графическом виде:

S000003473     0.986 0.940 1423  Bacillus subtilis (T); DSM10; AJ276351

S000006847     0.986 0.942 1435  Bacillus mojavensis (T); IFO15718; AB021191

S000012241     0.988 0.992 1440  Bacillus vallismortis (T); DSM11031; AB021198

S000014133     0.988 0.969 1426  Bacillus atrophaeus (T); JCM9070; AB021181

S000428475     0.988 0.935 1337  Bacillus subtilis (T); NRRL B-23049; AF074970

S000734915     0.986 0.960 1389  Bacillus amyloliquefaciens (T); NBRC 15535; AB255669

S001239910     0.980 0.903 1355  Bacillus methylotrophicus (T); CBMB205; EU194897

S001576866     0.981 0.965 1433  Bacillus siamensis (T); PD-A10; GQ281299

S002234727     0.984 0.926 1374  Bacillus tequilensis (T); 10b; HQ223107

S002287710     0.980 0.887 1469  Bacillus licheniformis (T); ATCC 14580; DSM 13; CP000002

S004067890     0.986 0.976 1453  Bacillus amyloliquefaciens (T); DSM7; FN597644

По данным анализа RDP II 16S рРНК было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами Bacillus subtilis СНБС-1 (см. чертеж).

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК (99 %), а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров тестируемый штамм отнесен к виду Bacillus subtilis.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные споровые палочки, расположенные беспорядочными скоплениями.

Культуральные признаки.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс.%): ферментативный пептон – 1,0; натрий хлористый – 0,5; агар – 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2, формирует желтые округлой формы колонии, диаметром до 5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1 - 7,5, формирует желтые округлой формы колонии, диаметром до 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки – 1,0; панкреатический гидролизат казеина – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,2; натрия фосфат однозамещенный – 0,2; D-глюкоза – 4,0; агар – 1,0; вода дистиллированная – остальное; рН 6,0±3, формирует непрозрачные желтоватые колонии, диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне (масс. %): ферментативный пептон – 1,0, натрий хлористый – 0,5, вода мясная – остальное; рН 7,0-7,2, образуют муть и пленку на поверхности бульона.

На минеральной среде Мюнца (см. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки. - Микробиология, 1963, №5- С.1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава: (масс. %) KNO₃ – 0,4; MgSO₄ ·7H₂O – 0,08; NaCl – 0,1; K₂ HPO₄ –0,14; KH₂ PO₄ –0,06; агар-2,0; нефть или нефтепродукты – 1,0; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, растет в виде серовато-желтых выпуклых колоний диаметром 1 мм.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм аэроб, растёт при температуре от +5 до +40°С, более интенсивно растет +16…+37°С. Растёт при рН 5,5 – 9,0. Оптимум рН 6,0 – 8,0. Растёт в солевом бульоне с добавлением 0,1 - 2,0% NaCl.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные неиспользуемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия. Штамм индол-отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета-галактозидазу. Утилизирует инозит. Продукт, синтезируемый штаммом: поверхностно-активные вещества, способные деструктировать нефть. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.

Штамм не токсичен по отношению к высшим растениям. Биотестирование проведено на семенах овса обыкновенного и редьки масличной.

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Bacillus subtilis СНБС-1.

Штамм бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 выделен из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого 1,0 г мерзлого грунта с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава: (масс. %) KNO₃ – 0,4; MgSO₄ ·7H₂O – 0,08; NaCl – 0,1; K₂ HPO₄ –0,14; KH₂ PO₄ –0,06; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. На первом этапе инкубация проводилась в качалочных условиях при 200 об/мин и температуре +20±1°С. Рост бактерий наблюдали уже через 3 дня инкубации по образованию мутной эмульсии и с дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +5 до +40°С. Через 72 ч на поверхности МПА наблюдали появление пастообразных блестящих колоний желтого цвета, диаметром до 5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (см. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p. 408) идентифицированы как штамм Bacillus subtilis .

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1.

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевали на скошенный МПА и инкубировали 48 часов при температуре +20±1°С. Выросшие на МПА культуры Bacillus subtilis СНБС-1 смывали 0,9 % раствором NaCl; готовили исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1х10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.

Для получения препарата готовили жидкую минеральную среду по примеру 1 и культивировали в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов, при температуре 20±1°С, при 200 оборотах/мин. Полученную жидкую смесь клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1, с титром 1х10⁹ клеток/см³ использовали в качестве препарата для обработки почвы и воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Bacillus subtilis СНБС-1.

Клетки штамма Bacillus subtilis СНБС-1 смывают 0,9 % раствором NaCl со скошенного мясопептонного агара. Готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1х10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Bacillus subtilis СНБС-1 культивируют в водной среде с минеральным составом по примеру 1 в условиях постоянной аэрации.

В колбочки объемом 250,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10⁹ клеток/ см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторениях. Колбы культивируют при разных температурах (от +5°C до +40°С) в течение 3-5 суток.

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 3-и сутки при температуре +5°C утилизирует 4,8-5,4 % - нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C – 57,2-57,8%; при температуре +30°C – 62,6 – 63,7 %, при температуре +40°C – 52,2-52,8%; в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 1).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1.

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят по 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Bacillus subtilis СНБС-1 (по примеру 2), содержащего 1,0·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 45 суток при температуре +20±1˚С.

Биодеградацию нефти определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025» (см. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Полученные результаты показали, что в воде под влиянием штамма Bacillus subtilis СНБС-1 за 45 суток деструкция нефти составила 68,2 %. Деструкция в контрольной ёмкости без добавления штамма Bacillus subtilis СНБС-1 – 2,3% за тот же промежуток времени (см. таблицу 2).

Пример 5. Очистка почвы от нефтезагрязнений с помощью клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1.

Опыты с применением клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1 для очистки почвы от нефти проведены на супесчанной почве в условиях модельного опыта. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до обработки почв клетками штамма Bacillus subtilis СНБС-1 составило 3000 мг/кг, что соответствовало среднему уровню загрязнения в соответствии с нормативными документами (см. Письмо Минприроды России от 27.12.1993 г. № 04-25/61-5678 «О порядке определения размеров ущерба от загрязнения земель химическими веществами»; Методические рекомендации по выявлению деградированных и загрязненных земель. Комитет РФ по земельным ресурсам от 27 марта 1995 г. № 3-15/582, 29 с.).

Эффективность применения штамма Bacillus subtilis СНБС-1 оценивали по степени деградации нефтезагрязнения в почвенных образцах, отобранных для анализа до и после внесения микробной суспензии согласно инструкции (см. РД 39-0177098-015-90 «Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтепрома»).

Для этого образцы почвы до и после обработки биопрепаратом подвергались экстракции в аппарате Сокслета четыреххлористым углеродом, после чего экстрагент удаляли перегонкой с дефлегматором, доводя остаток до постоянного веса. Определение влажности образцов проводили общепринятым методом (см. ГОСТ 28268-89 «Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности»), после чего производили перерасчет содержания нефтепродуктов на сухую почву.

Установлено, что степень биодеградации нефтепродуктов в опытных образцах через 45 суток после однократной обработки почв бактериальной суспензией на основе клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1 составила при температуре +5±1ºС – 9,3%; при температуре +20±1ºС – 56,6%; при температуре +30±1ºС – 61,6%; при температуре +40±1ºС – 53,9% (см. таблицу 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 3 до 45 суток), в широком диапазоне температур от +5 до +40°С, может быть использован как для очистки почвы, так и для очистки воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Таблица 1

Степень утилизации нефтепродуктов штаммом Bacillus subtilis СНБС-1

в водной среде с минеральными компонентами

Таблица 2

Деструкция нефти в воде штаммом Bacillus subtilis СНБС-1

Таблица 3

Деструкция нефтепродуктов в почве под влиянием клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1