БЕНЗИЛУРСОНАТ - ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ И ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно к новому соединению - бензиловому эфиру 3-оксо-урсан-12-ил-28-оевой кислоты (бензилурсонату), по номенклатуре IUPAC - (1S,2R,4aS,6aS,6bR,12aR,12bR,14bS)-бензил-1,2,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-10-оксо-1,2,3,4,4а,5,6,6а,6b,7,8,8а,9,10,11,12,12а,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоксилату формулы I:

обладающему противовоспалительной и гепатопротекторной активностью, что сделает возможным использование соединения в медицине в качестве лекарственного средства.

Среди современных противовоспалительных средств набольшее распространение получили синтетические аналоги глюкокортикоидов и нестероидные противовоспалительные препараты. Серьезным недостатком обеих групп являются многочисленные побочные эффекты, ограничивающие продолжительность и снижающие эффективность лечения. Так, под действием гормональных препаратов (гидрокортизон, преднизолон, кеналог, медрол, дексаметазон и др.) в организме развивается задержка натрия и воды, усиление выведения калия и кальция, нарушение иммунитета, изъязвление желудочно-кишечного тракта, нервные и психические нарушения и т.д. [М.Д.Машковский. Лекарственные средства (в двух томах). Харьков, Изд. «Торсинг», . 1998, т.2, с.55]

Нестероидные противовоспалительные препараты (аспирин, индометацин, ибупрофен и др.) не вызывают подобных системных расстройств, однако для них характерно прямое ульцерогенное действие на слизистую желудка и кишечника, а также неблагоприятное влияние на состав и свертываемость крови [М.Д.Машковский. Лекарственные средства (в двух томах). Харьков, Изд. «Торсинг», 1998, т.2, с.55].

Наименее токсичными для организма считаются растительные препараты с противовоспалительной активностью - танин, сальвин, рекутан, ромазулон, калефлон и др., представляющие собой водно-спиртовые экстракты соответствующих лекарственных растений или их смеси. Однако в силу особенности механизма действия, основанного на вяжущих свойствах, они ограниченно применяются в качестве местных противовоспалительных средств [М.Д.Машковский. Лекарственные средства (в двух томах). Харьков, Изд. «Торсинг», 1998, т.2, с.55]. Тем не менее, растительные соединения остаются одним из потенциально ценных источников малотоксичных средств с высокой противовоспалительной активностью, при этом приоритет отдается индивидуальным агентам, выделенным из растительного сырья, и их синтетическим производным.

Анализ литературных данных показывает, что таким перспективным базовым соединением может стать урсоловая кислота. Сообщалось, что урсоловая кислота, выделенная из цветков вереска, ингибирует метаболизм арахидоновой кислоты [А.Najid, A.Simon, J.Cook, H.Chable-Rabinovitch, et al. Characterization of ursolic acid as a lipoxygenase and cyclooxygenase inhibitor using macrophages, platelets and differentiated HL60 leukemic cells // FEBS Lett. 1992, V.299, p.213-217], а также подавляет синтез циклооксигеназы-2 и простагландинов в клетках эпителия человека [K.Subbaramaiah, P.Michaluart, М.В.Sporn, A.J.Dannenberg. Ursolic acid inhibits cyclooxygenase-2 transcription in human mammary epithelial cells // Cancer Res, 2000, V.60, p.2399-2404]. На модели каррагенинового отека лапы крыс показано, что урсоловая кислота, содержащаяся в метанольном экстракте листьев Mallotus Pentatum, проявляет выраженную противовоспалительную активность, не уступающую нестероидному противовоспалительному препарату индометацину [D.Chattopadhyay, G.Arunachalam, А.В.Mandal, Т.К.Sur et al. Antimicrobial and anti-inflammatory activity of folklore: Mallotus peltatus leaf extract. J.Ethhnopharmacology, 2002, V.82, p.229-237]. Кроме противовоспалительного действия урсоловая кислота оказывает антиоксидантный и гепатопротекторный эффект [J.Liu. Oleanolic acid and ursolic acid: Research perspectives. // J. of Ethnopharmacology, 2005, V.100, p.92-94] и, таким образом, может рассматриваться как агент с комплексной активностью. Экспериментально установлено, что это соединение является малотоксичным [L.Novotny, A.Vachalkova, D.Biggs. Ursolic acid: an antitumorogenic and chemopreventive activity. Minireview // Neoplasma. 2001. V.48. P.241-246].

Недостатком урсоловой кислоты можно считать ее низкую растворимость в полярных и неполярных растворителях. Однако для сложных эфиров урсоловой кислоты характерна более высокая растворимость в неполярных растворителях, поэтому они могут быть перспективны в качестве биологически активных соединений. Показано, что один из эфиров - бензилурсолат, обладает фотопротекторной активностью и препятствует старению кожи [K.Matsumoto, H.Tsuruoka, N.Fujiwara, Y.Nishimori, Y.Kenjo. Photoaging skin-care preparation and method of treating wrinkled skin. US 6338854, 15.01.2002]. В настоящее время препаратов, полученных на основе производных урсоловой кислоты, в нашей стране и за рубежом не производится.

Задачей изобретения является создание на основе урсоловой кислоты препарата с высокой противовоспалительной и гепатопротекторной активностью, получаемого из доступного возобновляемого отечественного сырья.

Решение поставленной задачи достигается созданием соединения формулы I, представляющего собой бензиловый эфир урсоловой кислоты (бензилурсонат), обладающего противовоспалительной и гепатопротекторной активностью.

Эталонным препаратом по противовоспалительному действию является нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция «Fluka» BioChemika).

Референсным соединением по фармакологическим свойствам является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы II, обладающий антиоксидантной, капилляро-, и гепатопротекторными свойствами [М.Б.Плотников, Н.А.Тюкавкина, Т.М.Плотникова. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск: Изд-во Томского университета, 2005, 228 с.]:

Прототипом заявляемого соединения и его аналогом по структуре и биологическим свойствам является урсоловая кислота III

В качестве исходного соединения для синтеза бензилурсоната используют урсоловую кислоту, которую получают из доступных отходов пищевой промышленности от производства соков - шротов черноплодной рябины и клюквы, или бензилурсолат, который получают бензилированием экстрактов брусники [С.А.Попов, Л.П.Козлова, Е.П.Романенко, Т.П.Кукина. Способ получения бензилурсолата из экстрактивных веществ брусники. Заявка №2009101745 от 20.01.2009].

Соединение I получают путем алкилирования урсоловой кислоты III бензилхлоридом в диметилформамиде в присутствии карбоната калия. При этом получают бензилурсолат IV, который отделяют фильтрацией после выливания реакционной смеси в воду. Окисление бензилурсолата бихроматом калия в присутствии серной кислоты приводит к получению целевого продукта - бензилурсоната I (см. схему).

Биологическая активность соединения I изучалась путем определения противовоспалительных, гепатопротекторных и антиоксидантных свойств на беспородных мышах. В качестве препаратов сравнения использовали нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция «Fluka» BioChemika) и антиоксидант дигидрокверцетин (II) (99,9% чистоты). Структурным аналогом изучаемого соединения являлась урсоловая кислота (III).

Противовоспалительную активность бензилурсоната I исследовали на стандартных моделях воспаления, вызываемого гистамином и каррагенином [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, изд-во ОАО Медицина, 2005, 240 с]. Соединение I и его структурный аналог вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за 1 час до субплантарного введения флогогена. Препарат сравнения индометацин вводили тем же способом в эффективной дозе 20 мг/кг. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению, по сравнению с контролем, индекса отека, который рассчитывали в процентах как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой. В условиях воспаления, вызванного гистамином, бензилурсонат (I) превосходил по противовоспалительной активности свой структурный аналог и не уступал эталонному препарату индометацину. На каррагениновой модели воспаления соединение I по выраженности противовоспалительной активности не отличалось от урсоловой кислоты, но незначительно уступало индометацину (таблицы 1, 2).

Для исследования антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического CCl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, изд-во ОАО Медицина, 2005, 240 с.]. Токсический гепатит моделировали путем внутрижелудочного введения мышам 25% раствора CCl₄ в растительном масле. Соединение I вводили в желудок в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение -дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом в дозе 50 мг/кг. Гепатопротекторный эффект определяли по снижению в сыворотке крови маркеров цитолиза и холестаза - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Антиоксидантные свойства оценивали по уменьшению концентрации продуктов перекисного окисления (ТБКРС), определяемых по реакции с тиобарбитуровой кислотой [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: «Беларусь», 2000, т.2, с.207]. Пробы сыворотки крови отбирали через сутки после введения агентов. Анализ биохимических показателей проводили с использованием стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум», Германия) на биохимическом анализаторе (фотометр 5010, Германия).

Установлено, что соединение I при внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг обладает гепатопротекторным действием, снижая в 2-3 раза выраженность цитолитических процессов и в 1,4 раза тяжесть холестаза на фоне токсического гепатита (табл.3).

По антицитолитическому эффекту соединение I не уступает урсоловой кислоте и дигидрокверцетину и превосходит их по антихолестазным свойствам (табл.4). Показано, что соединение I незначительно уступает по антиоксидантной активности референсным агентам.

Таким образом, новое соединение - (1S,2R,4aS,6aS,6bR,12aR,12bR,14bS)-бензил-1,2,6а,6b,9,9,12а-гептаметил-10-оксо-1,2,3,4,4а,5,6,6а,6b,7,8,8а,9,10,11,12,12а,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоксилат формулы I (бензилурсонат) обладает следующими преимуществами, а именно:

- выраженной противоспалительной активностью, превосходящей таковую активность урсоловой кислоты и не уступающей активности стандартного препарата индометацина;

- более высоким гепатопротекторным эффектом по сравнению с урсоловой кислотой и дигидрокверцетином;

- использованием в синтезе заявляемого соединения доступной урсоловой кислоты, получаемой из отходов пищевой промышленности, или бензилурсолата, получаемого из экстрактов шротов брусники.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение (1S,2R,4aS,6aS,6bR,12aR,12bR,14bS)-бензил-1,2,6a,6b,9,9,12a-гептаметил-10-оксо-1,2,3,4,4а,5,6,6а,6b,7,8,8а,9,10,11,12,12а,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоксилата (I).

К суспензии урсоловой кислоты (10 г, 21.9 ммоль) в ДМФА (50 мл) добавляют измельченный K₂CO₃ (4,5 г, 32.5 ммоль) и PhCH₂Cl (3.02 г, 23.8 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре 4 час. Реакционную смесь выливают в воду 200 мл и отфильтровывают, в результате получают 9.8 g (82%) бензилового эфира урсоловой кислоты т.пл. 185-186°С (EtOH).

К перемешиваемой суспензии безилурсолата III (5 г, 9.1 ммоль) в смеси CH₂Cl₂ (20 мл) и ацетона (20 мл) добавляют раствор реактива Джонса (9 мл, 3 эквивалента) при 5°С в течение 0.5 ч. После перемешивания смеси в течение 1 добавляют смесь изопропилового спирта (20 мл) и воды (20 мл). Смесь перемешивают в течение 1 час, разбавляют водой (100 мл) и экстрагируют CH₂Cl₂ (3×50 мл). Органический экстракт концентрируют, фильтруют через короткую колонку с Al₂O₃ (элюент - CCl₄) и полученный фильтрат упаривают, получая бензилурсонат 4.6 г (83%) в виде белых кристаллов 158-160°С (MeCN), α²⁵+76 (с 1.0, CHCl₃).

Спектр ЯМР С¹³ (CDCl₃, 75 MHz, δ_C м.д.): 15.08 к; 16.85 к; 16.87 к; 19.47 т; 21.02 к; 21.37 к; 23.29 т; 23.35 к; 24.11 т; 26.45 к; 27.82 т; 30.54 т; 32.43 т; 34.04 т; 36.48 с; 36.53 т; 38.70 д; 38.99 д; 39.19 с; 39.38 т; 42.04 с;; 47.26 с; 46.65 д; 48.03 с; 52.85 д; 55.15 д; 65.87 т; 128.05 д; 128.05 д; 138.10 с; 128.28 д; 128.28 д; 136.22 с; 125.35 д; 127.83 д; 177.10 с; 217.63 с.

Спектр ЯМР H¹ (CDCl₃, 300 MHz, δ_C м.д.): 0.70 с (3Н); 0.87 д (6.4) (3Н); 0.95 д (А'В ₃ ', J_B'A'=5.8 (3H)); 1.04 с (3Н); 1.06 с (3Н);

1.10 с (6Н); 1.93 дд (8.3, 3.6); 2.30 д (11.2); 2.39 ддд (ABXY, J_BA=16.0, J_BX=6.9, J_BY=3.8 (H^2ed)); 2.56 ддд (ABXY, J_AB=16.0, J_AX=10.9, J_AY=7.2 (H^2ax));

5.07 (A''B'',_ΔνA''B''=35.5 Гц, J_A''B''=12.4 (2Н)); 5.27 дд (3.6, 3.6); 7.36 м (5Н).

Пример 2. Исследование противовоспалительных свойств на модели гистаминового воспаления.

Эксперименты проводили на беспородных мышах самцах массой 20-25 г. Животных делили на группы по 8 особей. Соединение I вводили внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Отдельным группам мышей аналогично вводили структурный аналог - урсоловую кислоту в дозе 20 мг/кг, а также эталонный противовоспалительный препарат индометацин в эффективной дозе 20 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентное количество водно-твиновой эмульсии. Через 1 час после введения агентов всем мышам субпланарно в заднюю лапу введен 0,5% водный раствор гистамина по 0,05 мл/мышь. Через 5 часов после введения флогогена мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса воспаления, который определяли как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной, выраженное в процентах. Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считали достоверными с вероятностью р<0,05.

Данные эсперимента приведены в таблице 1. Показано, что соединение I снижало в 2,3 раза выраженность отека лапы мышей, тогда как урсоловая кислота уменьшала отек в 1,8 раза, а индометацин - в 2,1 раза. Таким образом, в условиях воспаления, вызванного гистамином, бензилурсонат (I) превосходил по противовоспалительной активности свой структурный аналог и не уступал эталонному препарату индометацину.

Таким образом, установлено, что соединение I обладает противовоспалительной активностью, не уступающей нестероидному противовоспалительному препарату индометацину.

Пример 3. Исследование противовоспалительных свойств на модели каррагенинового воспаления.

В опыт брали беспородных мышей самцов массой 20-25 г, которых делили на группы по 8 особей. Соединение I и агенты сравнения (урсоловая кислота и индометацин) вводили внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Контрольные животные получали эквивалентное количество водно-твиновой эмульсии. Через 1 час после введения агентов всем мышам субпланарно в заднюю лапу введен 1,5% водный раствор полисахарида каррагенина по 0,05 мл/мышь. Через 5 часов после введения флогогена мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса воспаления, который определяли как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной, выраженное в процентах. Данные эсперимента приведены в таблице 2. Установлено, что на фоне введения каррагенина урсоловой кислоты и ее производного отмечена тенденция к противовоспалительному действию, выразившаяся в снижении воспалительного отека в 1,1 раза относительно контроля. Индометацин в этих же условиях достоверно уменьшил величину воспалительного отека лапы в 1,2 раза. Можно отметить, что соединение I в данном опыте проявило противовоспалительный эффект, аналогичный по выраженности урсоловой кислоте, но меньший, чем у индометацина, в 1,1 раза.

Таким образом, в условиях каррагениновой модели воспаления соединение I по выраженности противовоспалительной активности не отличалось от урсоловой кислоты, но незначительно уступало индометацину.

Пример 4. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатита.

Острый токсический гепатит вызывали у беспородных самцов мышей массой 20-25 г путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора CCl₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,1 мл на 10 г массы тела [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, изд-во ОАО Медицина, 2005, 240 с.]. Соединение I и урсоловую кислоту вводили за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Дигидрокверцетин вводили тем же способом в эффективной дозе 50 мг/кг. Контрольным животным вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. В каждой группе было по 9-10 особей.

Через сутки животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом и определяли в сыворотке крови мышей активность АЛТ, ACT и щелочной фосфатазы с помощью стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум», Германия).

Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».

Установлено, что соединение I в условиях токсического гепатита оказывает достоверный антицитолитический эффект, снижая активность АЛТ и ACT в крови соответственно в 3,2 и 2,0 раза по сравнению с контролем. Аналогичные эффекты у референсных агентов были выражены в меньшей степени: урсоловая кислота уменьшила активность АЛТ и ACT в 2,8 и 1,7 раза против контроля, а дигидрокверцетин - соответственно в 2,9 и 1,5 раза. Показано, что соединение I проявило тенденцию к антихолестазному действию, понизив в 1,4 раза уровень ЩФ в крови. Урсоловая кислота снижала данный показатель в 1,2 раза по сравнению с контролем. Дигидрокверцетин не проявил антихолестазного действия, достоверно повысив уровень ЩФ относительно контроля. Таким образом, соединение I обладает выраженным гепатопротекторным действием, не уступая своему структурному аналогу и эталонному препарату по антицитолитическому эффекту и превосходя их по антихолестазным свойствам (таблица 3).

Таким образом, показано, что соединение I при внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг обладает гепатопротекторным действием, снижая в 2-3 раза выраженность цитолитических процессов и в 1.4 раза тяжесть холестаза на фоне токсического гепатита.

Пример 5. Исследование антиоксидантных свойств на модели острого токсического гепатита.

Определение антиоксидантного эффекта соединения I проводили на модели токсического CCl₄ гепатита, описанной выше. Влияние агентов на выраженность процессов перекисного окисления липидов оценивали по уровню ТБК-реактивных соединений (ТБАРС) в сыворотке крови, которые являются вторичными продуктами перекисного окисления. Соединение I и агенты сравнения вводили за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Введенные дозы составили: для урсоловой кислоты и соединения I-20 мг/кг; для дигидрокверцетина - 50 мг/кг. Контрольным животным вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. В каждой группе было по 9-10 особей. Через сутки животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом и определяли концентрацию ТБАРС в сыворотке крови мышей общепринятым методом [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: «Беларусь», 2000, т.2, с.207]. Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считали достоверными с вероятностью р<0,05.

Установлено, что соединение I проявляет тенденцию к антиоксидантному действию, снижая в 1,2 раза концентрацию ТБКРС в крови, урсоловая кислота и дигидрокверцетин уменьшали данный показатель в 1,3 раза относительно контроля. При этом эталонный препарат оказывал достоверный эффект (таблица 4). Таким образом, соединение I незначительно уступало по антиоксидантной активности референсным агентам.