СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К КОМБИНИРОВАННОМУ ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДОВ МЕДИ, ЦИНКА И СВИНЦА

Изобретение относится к медицине, в частности к токсикологии наночастиц (нанотоксикологии), и может быть использовано для снижения неблагоприятных эффектов комбинированного действия наночастиц (НЧ) оксидов меди (CuO), цинка (ZnO) и свинца (PbO) на организм в группах риска, охватывающих лиц, которые подвергаются такому воздействию в производственных условиях, в частности в медеплавильной промышленности.

Опубликованы работы, в которых различными тестами и на различных биологических объектах демонстрируется, что цитотоксическое, системно-токсическое и генотоксическое действие металлических и металлооксидных частиц нанометрового диапазона значительно выше, чем соответствующее действие химически аналогичных частиц с размерами >100 нм (Boris A Katsnelson, Larisa I Privalova, Marina P Sutunkova, Vladimir В Gurvich, Nadezhda V Loginova, Ilzira A Minigalieva et al. (2015)). Some inferences rom in vivo experiments with metal and metal oxide nanoparticles: the pulmonary phagocytosis response, subchronic systemic toxicity and genotoxicity, regulatory proposals, searching for bioprotectors (a self-overview). International Journal of Nanomedicine, 10: 3013-309).

В частности, имеется немало экспериментальных данных о высокой токсичности и опасности наночастиц CuO (например, Chen Z, Meng Н, Xing G et al (2006) Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo. J Toxicol Lett 25:109-120; Karlsson H, Cronholm P, Gustafsson J et al (2008) Copper oxide nanoparticles are highly toxic: A comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. J Chem Res Toxicol 21:1726-1732; Studer AM, Limbach LK, Van Duc L et al (2010) Nanoparticle cytotoxicity depends on intracellular solubility: comparison of stabilized copper metal and degradable copper oxide nanoparticles. J Toxicol Lett 1:169-174; Magaye R, Zhao J, Bowman L et al (2012) Genotoxicity and carcinogenicity of cobalt-, nickel- and copper-based nanoparticles. J Exp Ther Med 4:551-561; Alarifi S, Ali D, Verma A et al (2013) Cytotoxicity and genotoxicity of copper oxide nanoparticles in human skin keratinocytes cells. Int J Toxicol 32: 296-307; Xu J, Li Z, Xu P et al (2013) Nanosized copper oxide induces apoptosis through oxidative stress in podocytes. J Arch Toxicol 87:1067-1073; Privalova L.I., Katsnelson, B.A., Loginova, N.V., Gurvich, V.B., et al. (2014). Subchronic toxicity of copper oxide nanoparticles and its attenuation with the help of a combination of bioprotectors. International Journal of Molecular Sciences 15, 12379-12406); ZnO (Wang B, Feng W-Y, Wang T-C et al (2006) Acute toxicity of nano- and micro-scale zinc powder in healthy adult mice. J Toxicol Lett 161(2):115-123; Cho W-S, Duffin R, Howie S et al (2011) Progressive severe lung injury by zinc oxide nanoparticles; the role of Zn2+ dissolution inside lysosomes. J Part Fib Toxicol 8:27; Adamcakova-Dodd A, Stebounova LV, Kim JS et al (2014) Toxicity assessment of zinc oxide nanoparticles using sub-acute and sub-chronic murine inhalation models. J Part Fib Toxicol 11:15; Jacobsen NR, Stoeger T, van den Brule S et al (2015) Acute and subacute pulmonary toxicity and mortality in mice after intratracheal instillation of ZnO nanoparticles in three laboratories. Food Chem Toxicol 85:84-95; Gao F, Ma NJ, Zhou H et al (2016) Zinc oxide nanoparticles induced epigenetic change and G2/M arrest are associated with apoptosis in human epidermal keratinocytes. Int J of Nanomedicine 11:3859-3874) и, в меньшей степени, PbO (Shaikh SM, Shyama SK, Desai PV (2015) Absorption, LD50 and effects of CoO, MgO and PbO nanoparticles on mice "Mus musculus". IOSR-JESTFT 9(2):32-38; Amiri A, Mohammadi M, Shabani M (2016) Synthesis and Toxicity Evaluation of lead oxide (PbO) nanoparticles in rats. Electronic J Biol 12:2).

Однако ни примеров изучения хронической системной токсичности тройной комбинации рассматриваемых оксидов, ни испытания или хотя бы теоретического обоснования средств биологической защиты (биопротекторов) от вредных эффектов длительного комбинированного воздействия на организм этих наночастиц информационный поиск не обнаружил. Что же касается изолированного действия компонентов рассматриваемой комбинации, то только в отношении токсичности наночастиц оксида меди ранее был предложен эффективный комплекс биопротекторов (патент Российской Федерации №2560682). Однако применение того же самого комплекса с целью биологической защиты от вредного действия комбинации наночастиц недостаточно обосновано, учитывая, что наночастицы оксидов меди, цинка и свинца имеют, наряду с общими для многих наночастиц, также метало-специфичные (в частности, характерные для свинца - самого опасного компонента этой комбинации) механизмы вредного действия, которые при комбинированной экспозиции вступают в сложные взаимодействия (И.А. Минигалиева (2016) Некоторые закономерности комбинированной токсичности металлооксидных наночастиц. Токс Вестник, №6:18-24).

Задачей изобретения является создание способа защиты, основанного на повышении устойчивости организма к вредным эффектам комбинированного действия наночастиц оксидов меди, цинка и свинца.

Технический результат заключается в снижении вредных эффектов токсического и генотоксического комбинированного действия наночастиц оксидов меди, цинка и свинца на организм.

Заявляется способ профилактики вредных эффектов органо-системного уровня, обусловленных комбинированным хроническим общетоксическим и генотоксическим действием указанных наночастиц на организм. Он заключается в том, что лицам, относящимся к группе риска этого действия, назначают комплекс биологически активных препаратов, включающий глютаминовую кислоту, глицин, цистеин в метаболически активной форме N-ацетилцистеина. пектиновый энтеросорбент, селен, йод, железо, кальций, препарат рыбьего жира, богатый полиненасыщенными жирными кислотами класса омега-3, а также витамины A, Д3, E и C, причем лица группы риска принимают препараты комплекса повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6 недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение в день 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глютаминовой кислоты, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием полиненасыщенных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, а также микроэлементы и витамины в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма.

Входящие в комплекс аминокислоты, а именно глютамат, глицин и цистеин, включены в него как предшественники биосинтеза восстановленного глютатиона, который является системным протектором от оксидативного и свободно-радикального повреждения клетки и субклеточных структур, характеризующего первичные механизмы цитотоксичности и генотоксичности различных металлосодержащих наночастиц, при том, что глютамат является еще и мощным стабилизатором клеточных мембран, а также важнейшим нейромедиатором центральной нервной системы, специфически повреждаемым свинцом. Антиоксидантным действием обладают также селен и витамины А, Е и C. Введение йода в состав биопротекторного комплекса обусловлено тем, что свинцовая интоксикация связана с нарушениями функции щитовидной железы, а введение железа - тем, что под влиянием свинца тормозится синтез гемма, в том числе, на заключительном этапе включения этого металла молекулу протопорфирина IX. Кальций в сочетании с витамином Д3 используется как хорошо известный антагонист многих токсикокинетических и токсикодинамических механизмов действия на организм того же свинца.

Пектиновый энтеросорбент в заявленном комплексе предназначен для блокирования кишечной абсорбции ионов металлов, образующихся при растворении наночастиц, перенесенных в желудочно-кишечный тракт после отложения в дыхательных путях, а также реабсорбции ионов выделенных печенью с желчью.

Заявленный комплекс содержит также препарат рыбьего жира, богатый не только вышеупомянутыми витаминами А и Д3, но также полиненасыщенными жирными кислотами класса омега-3, внутриклеточными производными которых являются эйкозаноиды, активирующие репликацию ДНК, тем самым играя важную роль в репарации ее повреждений.

То, что лицам группы риска рекомендовано принимать препараты комплекса повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6-недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение в день 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глютаминовой кислоты, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием полиненасыщенных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, а также селен, кальций, железо, йод и витамины в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма, обосновано пересчетом содержания перечисленных активных факторов в биопротекторном комплексе (БПК), защитная эффективность которого доказана в эксперименте, проведенном на лабораторных белых крысах. Пересчет в указанные дозы для человеческого применения осуществлен на основе соотношения уровней основного обмена крысы и человека с учетом также справочных и литературных данных о суточной потребности человека в этих факторах. Только дозы биомикроэлементов и витаминов обусловлены не таким пересчетом, а нормальными физиологическими потребностями организма, включая компенсацию эндогенной витаминной недостаточности и микроэлементного дисбаланса, возникающих при интоксикации.

Механизмы защитного действия входящих в комплекс биопротекторов сложны и, по-видимому, взаимно потенцируют друг друга. Важное значение могут иметь: (а) разное по молекулярным механизмам противорадикальное (в том числе, антиоксидантное) действие, в той или иной степени присущее ряду биопротекторов заявляемого комплекса (антиоксидантный синергизм); (б) мембрано-стабилизирующее действие глютамата, поскольку оно может препятствовать повреждению митохондрий наночастицами оксидов металлов и тем самым - оксидативному стрессу, являющемуся, по современным представлениям, одним из основных механизмов цитотоксического и генотоксического действия металлических наночастиц (например, , Е. Cellular targets and mechanisms in the cytotoxic action of non-biodegradable engineered nanoparticles. J. Curr. Drug. Metab. 2013, 14, 976-988).; (в) компенсация некоторых функциональных и биохимических нарушений, связанных с токсикодинамическими механизмами как общего характера, так и специфичных для конкретного вида наночастиц.

Характерной особенностью заявленного способа является комплексное использование всех вышеперечисленных механизмов. Впервые показано, что на фоне перорального назначения предложенной комбинации биопротекторов хроническая системная токсичность и генотоксичность наночастиц оксидов меди, цинка и свинца, воздействующих на организм совместно, могут быть существенно ослаблены. В результате поиска по источникам научно-технической и патентной литературы не выявлены средства, направленные на решение такой задачи.

Заявляемый способ экспериментально опробован на аутбредных белых крысах-самцах с начальным весом тела 150-220 г. Животные содержались в условиях специально организованного вивария, соответствующих ветеринарным требованиям. В питье они получали артезианскую воду, доочищенную до первой категории качества, в пищу - полнорационный комбикорм ООО «Лабораторкорм». Суспензии наночастиц изготавливались методом лазерной абляции соответствующих чистых (99,99%) металлов в деионизированной воде с помощью лазерной системы для обработки материалов Fmark-20 RL (ЦЛТ, Россия). Химический состав наночастиц определялся методом Рамановской спектроскопии и был идентифицирован как CuO, ZnO и PbO. Характеристика распределения размеров наночастиц давалась их прямым измерением при сканирующей электронной микроскопии и методом динамического рассеяния света с помощью анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Частицы CuO и PbO имели сферическую форму со средним диаметром (±σ) 24,5±4,8 нм и 47,0±16,0 нм соответственно. Частицы ZnO имели палочкообразную (близкую к цилиндрической) форму со средними размерами 83,0±20,0×30,0±11,0 нм. Для каждого введения животным использовались свежеприготовленные суспензии.

Водные суспензии наночастиц в дозировке 0,5 мг на крысу (каждого вида наночастиц в 1 мл соответствующей суспензии) вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 1 мг на крысу 18 раз по 3 раза в неделю. Во избежание прямого взаимодействия оксидов, ускоряющего агломерацию наночастиц, суспензии набирались в отдельные шприцы и вводились раздельно с интервалом около 1 минуты. Контрольным животным аналогичным образом вводили 3,0 мл той же стерильной деионизированной воды, на которой готовились суспензии. Отдельные группы животных получали те же инъекции на фоне перорального приема биопротекторного комплекса (БПК). Введение наночастиц и умерщвление животных разных групп проводились параллельно.

Препараты, содержащие вышеперечисленные биопротекторы, давались тем способом и в тех дозировках, которые приведены в Таблице 1.

Состояние организма крыс во всех группах оценивалось по большому числу (свыше 50) общепризнанных функциональных, биохимических и морфологических (с морфометрией при оптической и электронной микроскопии) критериев токсического действия. Для оценки генотоксического действия наночастиц «ин виво» использовали ПДАФ анализ (ПДАФ - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК), причем для характеристики степени повреждения ДНК использовали «коэффициент фрагментации», то есть отношение суммарной радиоактивности всех фракций «хвоста» к радиоактивности «ядра». Накопление металлов в организме, оцениваемое по их содержанию в центральном токсикокинетическом пуле - в крови, и их содержание в выделениях оценивали с помощью атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой на приборе ICAP 6500 DUO (Thermo scientific, USA).

Как видно из данных, приведенных в Таблице 2, важнейшим токсикокинетическим результатом воздействия БПК оказалось статистически значимое снижение содержания всех трех металлов в крови по сравнению с соответствующим показателем при затравке наночастицами без БПК (в 1,3 раза по меди, в 3,3 раза по цинку, в 3,7 раза по свинцу). Поскольку в рамках закономерностей токсикокинетики первого порядка концентрация металла в выделениях находится в динамическом равновесии с концентрацией в крови, неудивительно, что и в моче, и в кале на момент исследования (конец периода затравки) содержание всех трех металлов было под влиянием БПК также снижено. Однако само по себе уменьшение задержки этих металлов в организме, оцениваемой по их концентрациям в центральном токсикокинетическом пуле, каким является кровь, свидетельствует о том. что на протяжении значительной части затравочного периода элиминационная функция почек и печени (играющей особенную роль в выведении меди) была улучшена. В свою очередь, это улучшение объясняется защитой указанных органов выделения от токсического повреждения, обеспеченной влиянием БПК (Таблица 3).

Общая тенденция, выявленная при анализе функциональных показателей состояния организма, состоит в том, что все те, по которым при воздействии комбинации наночастиц без БПК выявлен тот или иной сдвиг по отношению к контрольной величине, особенно в том случае, если он статистически значим, как это имеет место почти по всем показателям, приведенным в Таблице 4. При таком же воздействии на фоне БПК он ослаблен - нередко до потери значимости отличия от контроля, в то время как отличие от группы, экспонированной к наночастицам без БПК, напротив, становится статистически значимым. В этом отношении особое внимание должно быть обращено на ослабление действием БПК:

- характерных для свинцовой интоксикации сдвигов содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче и содержания ретикулоцитов в крови;

- заторможенности исследовательского поведения и общей двигательной активности, являющейся, с одной стороны, одним из интегральных показателей большинства интоксикаций, но вместе с тем, вероятным признаком специфического нейротоксического действия свинца (преимущественно на гипокамп) и избыточной меди (преимущественно на базальные ядра).

Важнейшее значение имеет также показанное в Таблице 5 статистически значимое ослабление на фоне приема БПК генотоксического (прогностически - мутагенного и канцерогенного) эффекта, присущего всем до сих пор изученным металлическим и металло-оксидным наночастицам.

В данном эксперименте как центральная нейротоксичность комбинации наночастиц оксидов меди, цинка и свинца, так и ослабление этого эффекта на фоне приема БПК подтверждены гистологическим исследованием головного мозга с морфометрией повреждения нейронов базальных ядер и гиппокампа (Таблица 6).

Общее ослабление окислительно-восстановительных процессов в организме под влиянием токсического фактора, отражаемое снижением активности СДГ, которое теряет статистическую значимость при проведении затравки на фоне приема БПК (Таблица 4), также имеет морфологический коррелят - отмеченное во всех исследованных органах (печень, селезенка, почки, миокард, головной мозг, тимус, тестикулы) однотипное повреждение митохондрий с более или менее полным разрушением крист. При 3-балльной оценке распространенности такого повреждения получен (по всем органам в целом) общий балл, равный 2 в контрольной группе, 14 - при воздействии наночастиц без БПК и только 6 - при таком же воздействии на фоне приема БПК. На основе непараметрических критериев (the Friedman rank test and the Kruskal-Wallis test) найдено, что статистически значимы (Р<0,05) отличие обеих НЧ-экспонированных групп от контрольной, а также НЧ-экспонированной на фоне приема БПК от НЧ-экспонированной без БПК.

Сопоставление полученных данных с литературными свидетельствует о том, что впервые в токсикологическом эксперименте на целостном организме убедительно продемонстрированы, наряду с большим числом интегральных признаков хронической интоксикации, гепатотоксичность, нефротоксичность и специфическая нейротоксичность комбинации наночастиц оксидов меди, цинка и свинца, а также ее генотоксичность. При этом показано, что при использовании заявленного способа эти вредные эффекты существенно ослаблены.

Статистически значимое отличие от контрольного показателя обозначено индексом *, а от показателя группы крыс, получавшей комбинацию НЧ без БПК, - индексом ⁺ (Р<0,05 по t Стьюдента).

Статистически значимое отличие от контрольного показателя обозначено индексом *, а от показателя группы крыс, получавшей комбинацию НЧ без БПК, - индексом ⁺ (Р<0,05 по t Стьюдента).

Статистически значимое отличие от контрольного показателя обозначено индексом *, а от показателя группы крыс, получавшей комбинацию НЧ без БПК, - индексом ⁺ (Р<0,05 по t Стьюдента).

Статистически значимое отличие от контрольного показателя обозначено индексом *, а от показателя группы крыс, получавшей комбинацию НЧ без БПК, - индексом ⁺ (Р<0,05 по t Стьюдента).

Статистически значимое отличие от контрольного показателя обозначено индексом *, а от показателя группы крыс, получавшей комбинацию НЧ без БПК, - индексом ⁺ (Р<0,05 по t Стьюдента).