Способ улучшения морфогенеза черепа самцов и самок американской норки окрасочного генотипа Standart (+/+ +/+)

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу оценки влияния ветеринарных лекарственных средств на рост и развитие костей черепа американской норки, и может быть использовано при оценке влияния ветеринарных лекарственных средств на организм животных.

Известен способ определения безвредности лекарственных средств, включающий оценку общетоксического и специфического их действия (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией Р.У. Хабриева. – 2 изд., М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - С. 41-209).

Данные способы определения общетоксических свойств не включают в себя оценку влияния препарата на рост и развитие костной ткани. Лабораторные биохимические исследования сыворотки крови позволяют указывать на метаболические изменения в костной ткани у молодняка сельскохозяйственных животных (Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И., Таланов Г.А. и др. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики. Справочник. - ООО «Издательство» «КолосС», 2004. - С. 493), а также у норок (Никонова Э.Б. Физиологическая реактивность норок в постнатальном онтогенезе и пути ее коррекции. - Автореферат диссертации на соискание ученой степени д-ра биол. наук. - 2007. - С. 8).

Наряду с этим, многими исследователями в области ветеринарии и медицины доказана потенциальная возможность воздействия лекарственных средств на состояние, рост и дифференцировку костной ткани (Камышко В.Е. Морфофункциональная характеристика репаративной регенерации костной ткани у мелких домашних животных. - Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. вет. наук, 2000. - С. 21-22; Наумов А.В., Дыдыкина И.С., Дыдыкина П.С. - Реферативный медицинский журнал. Рубрика: Ревматология. - №7. - 21.04.2015. - С. 388).

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ определения краниометрических показателей американской норки Neovison vison с целью выявления факторов морфологического разнообразия черепа особей диких популяций, а также животных, содержащихся на звероферме (Кораблев Н.П., Кораблев М.П., Кораблев П.Н., Туманов И.Л. Российский Журнал Биологических Инвазий. – 2014. - №4. - С. 30-53).

Данный способ позволяет выявить показатели краниометрической изменчивости американской норки в зависимости от действия экологических факторов: ареала распространения, межвидовой конкуренции, особенностей кормового рациона, макроклиматических параметров, условий доместикации.

Способ не предполагает использование краниометрических параметров для характеристики влияния препарата на рост и развитие костей черепа американской норки, в том числе на различные окрасочные генотипы американской норки в условиях клеточного содержания.

Техническая задача, решаемая изобретением, заключается в расширении арсенала способов, используемых для тестирования общетоксических свойств ветеринарного лекарственного средства на американских норках различного генотипа, возраста и пола.

Сущность изобретения заключается в оценке влияния препарата на рост и развитие костей черепа американской норки, включающей краниометрические измерения и общее анатомическое исследование черепа, которые проводят в возрасте 45-50 дней, 3 месяца и 6 месяцев у самок и самцов американской норки окрасочных генотипов Standard (+/+ +/+), Lavender (а/а m/m) после введения Биостила с кормом в дозе 0,05 мл/кг массы тела (генотип Standard) и 0,0125 мл/кг массы тела (генотип Lavender) три раза в месяц 5-дневными курсами с интервалом 3 дня в течение пяти месяцев.

Использование указанного способа позволяет оценить влияние Биостила на рост и развитие костей черепа американской норки Standard (+/+ +/+) и Lavender (а/а m/m) в половозрастном и генотипическом аспекте и тем самым расширить арсенал способов и средств для изучения влияния препарата на организм животных.

В исследованиях по определению влияния биостила на развитие и рост черепа американских норок (MUSTELA VISON SCHREBER, 1777) использовали самцов и самок генотипов Standard (+/+ +/+), Lavender (а/а т/т) после отсадки от матерей (в возрасте 45-50 дней), принадлежащих ЦКП «Генофонды пушных и сельскохозяйственных животных» Федерального исследовательского центра Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН).

Животные были распределены на группы (опытные и контрольные) согласно генотипическим и половым признакам: первая опытная группа - самцы генотипа Standard; вторая опытная группа - самки генотипа Standard; третья и четвертая опытные группы - соответственно самцы и самки генотипа Lavender. В соответствии с имеющимися опытными группами были сформированы контрольные из особей-аналогов.

В период проведения опыта с июня по ноябрь животных кормили один раз в сутки утром по единому рациону согласно нормам из расчета на конечную живую массу зверей на 1 ноября: для самок 1,35 кг, для самцов 2,3 кг.

В 100 ккал обменной энергии корма содержится, г:

субпродукты говяжьи мягкие - 16,0;

отходы переработки птицы - 33,0;

субпродукты говяжьи костные - 10,0;

пшеница экструдированная -12,0;

жир животный - 2,5;

витаминный премикс из расчета 0,25 г на 1 голову в сутки.

На 100 ккал обменной энергии кормовой смеси приходится протеина 9,2 г и жира 4,5 г.

Вместе с кормом животные опытных групп получали биостил. Указанный препарат рекомендован для сельскохозяйственных животных и птиц, а также репродуктивного поголовья американской норки генотипа Standard (патент РФ №2282973, кл. A01D 67/00, A61K 31/14, A61K 31/205, A61K 35/12, A61K 31/32, A61K 35/34 от 14.10.2004; патент РФ 2 564 092 C1, МПК A61K 31/00, A01K 67/00).

Животные контрольных групп препарат не получали.

Пример 1. Оценка краниометрических показателей у американских норок генотипа Standard. В исследованиях использовали норчат после отсадки от матерей (в возрасте 45-50 дней) в количестве 125 голов. Из них были сформированы две опытные группы (40 гол. самок и 27 гол. самцов) и две контрольные (35 гол. самок и 23 гол. самцов). Норчата опытных групп были получены от родительских пар, которым добавляли в корм биостил перед гоном в течение 5 дней и в период гона трехкратно через день в дозе 0,05 мл/кг массы тела (патент RU 2564092 C1).

Щенкам опытных групп с 45-50-дневного возраста биостил назначали три раза в месяц 5-дневными курсами с интервалом 3 дня в течение пяти месяцев (табл.1). Для более точного дозирования навеску препарата смешивали с небольшой порцией корма и скармливали за 15-20 мин до основного кормления. Норчата контрольной группы препарат не получали.

Материалом для исследования служили головы (черепа) самок и самцов американской норки генотипа Standard.

Для изучения морфологических особенностей черепа проводили эвтаназию животных в соответствии с определенным возрастом и полом (табл.2), с соблюдением правил «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (1986).

Черепа норок указанных возрастных групп обрабатывали методом вываривания. Мышцы черепа препарировали с помощью различных анатомических инструментов. Затем черепа обезжиривались при помощи мыла и щетки, фиксировались (отбеливались) в 3%-ном растворе перекиси водорода в течение 15-20 минут (кроме черепов самок в возрасте 6 месяцев) и высушивались. Краниометрические измерения проводились по методике, изложенной в «Определителе позвоночных животных фауны СССР» (1975) с помощью электронного штангенциркуля ЗУБР 34463-150 с точностью 0,01 мм.

Для подтверждения данных краниометрических исследований проводили анатомическое исследование черепа, обращая внимание на следующие параметры его развития: поверхность черепа; наличие границ между лицевым и мозговым отделом, носовой, лобной и верхнечелюстной костями, а также между лобной и теменной костями; развитие скуловых отростков лобной кости, затылочного, сагиттального и вентрального гребня, барабанного пузыря; формирование зубов.

Результаты краниометрических измерений у самок представлены в таблице 3.

Согласно данным табл. 3, краниометрические показатели достоверно отличаются между особями опытной и контрольной группы в 40-50-дневном возрасте по таким показателям, как общая и кондилобазальная длина черепа, скуловая и мастоидная ширина черепа, которые у самок опытных групп имеют более высокие значения.

В последующие возрастные периоды краниометрические показатели у самок опытных и контрольных групп не имеют достоверных различий.

При общем анатомическом исследовании черепа самок установлено, что в возрасте 40-50 дней черепа самок опытной группы более крепкие, имеют больший размер и более развитый затылочный гребень.

В 86-90-дневном возрасте размеры черепа и основные показатели его развития у самок контрольных и опытных групп достоверно не отличаются, за исключением особенностей сагиттального гребня, который у 67% норок опытной группы находится на определенной стадии формирования, в то время как у такого же количества норок контрольной группы он не выражен и находится в зачаточном состоянии.

В возрасте 176-180 дней размеры черепа и основные показатели его развития у самок опытных и контрольных групп не отличаются (фиг. 1). Как и в предыдущем возрастном периоде обращает на себя внимание особенность развития сагиттального гребня, который у 33% особей опытной группы хорошо выражен, а у 67% не сформирован. При этом у аналогов из контроля сагиттальный гребень хорошо выражен только у 25% особей, а не сформирован у 75% животных.

Результаты краниометрических измерений у самцов представлены в таблице 4.

Как видно из данных табл. 4, краниометрическая характеристика самцов имеет особенности в каждом возрастном периоде. С возрастом показатели краниометрии черепа у особей контрольных и опытных групп изменяются в сторону увеличения значений, характеризующих активный рост черепа в длину и ширину.

При сравнении показателей у норок опытных и контрольных групп отмечено, что достоверные отличия краниометрических параметров определяются в возрасте 40-50 и 176-180 дней и отсутствуют в 86-90-дневном возрасте. При этом в первый исследуемый период (40-50 дней) значения отдельных показателей (общая и кондилобазальная длина черепа, скуловая и мастоидная ширина черепа, длина твердого неба) у самцов опытных групп существенно превышают их значения у аналогов из контроля.

Основные краниометрические показатели у особей опытных и контрольных групп в функциональный период, характеризующий репродуктивную зрелость животных, отличаются и достигают более высоких значений у самцов опытных групп (табл. 4).

При анатомическом исследовании черепа выявлено ряд закономерностей, указывающих на особенности роста и развития черепа самцов норок опытных и контрольных групп. Так, в возрасте 40-50 дней черепа самцов опытной группы крепкие, по размеру больше, затылочный гребень развит лучше, скуловые дуги шире, сосцевидные отростки по величине больше.

В возрасте 86-90 дней размерные характеристики черепа достоверно не отличаются. Кроме того, у самцов опытной группы скуловые дуги тоньше, сагиттальный гребень развит лучше и выделяется над поверхностью черепа, нижняя челюсть сохраняет форму и при обработке, в отличие от особей контрольных групп, не распадается по резцовому шву. У самцов контрольной группы сагиттальный гребень находится в стадии формирования. У особей обеих групп затылочный гребень одинаково развит, развитие зубов и их количество соответствует зубной формуле.

В 176-180-дневном возрасте у самцов опытных групп размеры черепа и некоторые показатели его развития отличаются. Черепа самцов, получавших с кормом биостил, достоверно больше в длину, с более шероховатой поверхностью, чем у самцов контрольной группы (фиг. 2). Указанный тип черепной поверхности характерен для всех взрослых самцов в возрасте 11 мес и старше.

Сагиттальный гребень хорошо развит у 61,5% особей опытной группы и у 54,5% контрольной. Затылочный гребень характеризуется лучшими параметрами развития у самцов опытной группы.

Таким образом, результаты исследований указывают о положительном влиянии биостила на рост и развитие черепа особей генотипа Standard, которое наиболее выражено в группе самцов репродуктивного периода.

В связи с возрастными особенностями развития организма норок оценка влияния препарата наиболее результативна при использовании комплексного метода исследований, что подтверждается следующими данными:

- влияние биостила на рост и развитие черепа самцов и самок в возрасте 40-50 дней можно определить как с помощью краниометрии, так и способом анатомического исследования;

- в возрасте 86-90 дней влияние препарата можно оценить только при общем анатомическом исследовании черепа, позволяющем характеризовать развитие затылочного и сагиттального гребней. Размерные характеристики черепа (количественные показатели) у особей опытных и контрольных групп в этом возрасте не отличаются;

- в репродуктивном периоде наиболее выражено влияние препарата на самцов и его можно оценить как с помощью краниометрии, так и способом анатомического исследования.

Пример 2. Оценка краниометрических показателей у американских норок генотипа Lavender (а/а m/m).

В научных исследованиях использовали норчат после отсадки от матерей (в возрасте 45-50 дней) в количестве 99 гол., из которых были сформированы две опытные группы (14 гол. самок и 14 гол. самцов) и две контрольные (39 гол. самок и 32 гол. самцов). Щенки опытных групп, как и в примере №1, были получены от родительских пар, которые получали биостил перед гоном в течение 5 дней и в период гона трехкратно через день в дозе 0,05 мл/кг массы тела (патент РФ 2564092 С1).

Щенкам опытных групп с 45-50-дневного возраста добавляли в корм биостил в дозе 0,0125 мл/кг массы тела по схеме, указанной в примере 1: три раза в месяц 5-дневными курсами с интервалом 3 дня в течение пяти месяцев (табл. 1). Норчатам контрольной группы препарат не применяли.

Материалом для исследования служили головы (черепа) самок и самцов американской норки генотипа Lavender (а/а m/m).

Для определения краниометрических показателей и анатомических особенностей черепа проводили эвтаназию животных в соответствии с определенным возрастом и полом (табл. 5).

Обработку черепов и краниометрические измерения проводили по методике, указанной в примере 1.

Результаты краниометрических измерений у самок представлены в таблице 6.

Данные таблицы указывают на незначительные отклонения в развитии черепа у самок опытных групп. В 40-50-дневном возрасте у самок опытной группы обнаружены отличия от аналогов из контроля только по одному показателю - длине нижней челюсти. У особей, родившихся от родителей, которые получали в период гона Биостил, нижняя челюсть была короче на 1,9 мм (6,35%).

В последующий возрастной период (86-90 дней) значения краниометрических показателей у самок опытных и контрольных групп достоверно не отличаются.

В возрасте 176-180 дней у самок опытных групп установлено достоверное уменьшение ширины носового отдела и высоты нижней челюсти по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы.

При анатомическом исследовании черепов самок опытных и контрольных групп в 40-50-дневном возрасте черепа имеют гладкую поверхность и очень хрупкие. Граница между лицевым и мозговым отделом черепа отсутствует. Носовая кость имеет границу между лобной и верхнечелюстной костями и между лобной и теменной костями. Начинают развиваться скуловые отростки лобной кости и затылочный гребень. Определяется четкая граница между пластинкой небной кости и небным отростком верхнечелюстной кости. Вентральная поверхность тела затылочной кости гладкая, без вентрального гребня; клиновидная кость в виде ровной пластинки, имеет четкие границы; барабанный пузырь имеет форму «почки».

У самок контрольной группы выделяется затылочный гребень на начальной стадии развития, а у животных опытной группы он не развит.

В возрасте 86-90 дней достоверных различий в строении черепа особей контрольной и опытной групп не обнаружено. Граница между лобной и теменной костями отсутствует. Скуловые отростки лобной кости притуплены. Формируются вентральный гребень тела затылочной кости, сагиттальный гребень и каудальный вырост лобной кости (глазнично-височный гребень лобной кости или граница между лицевым и мозговым отделом черепа). Сагиттальный гребень в виде углубленной линии вдоль поверхности черепа или зачатка. Границы клиновидной кости слабо выражены. Барабанный пузырь в форме треугольника.

В 176-180-дневном возрасте самки имеют крепкий череп со слегка шероховатой поверхностью. Границы носовой и клиновидной костей, а также граница между пластинкой небной кости и небным отростком верхнечелюстной кости стерты. Скуловые отростки лобной кости достигли окончательного развития, заострены. Каудальный вырост лобной кости (глазнично-височный гребень лобной кости или граница между лицевым и мозговым отделом черепа) просматривается в виде буквы «л». Хорошо развит затылочный гребень. Небная щель имеет два резцовых отверстия. Барабанный пузырь в форме «неравностороннего треугольника».

Черепа самок контрольной группы крупнее (фиг. 3).

Сагиттальный гребень у самок опытной группы не сформирован. В контрольной группе он развит у 29% самок.

Краниометрические параметры у самцов Lavender (а/а m/m) опытной и контрольной группы представлены в таблице 7.

Из данных табл.7 следует, что в возрасте 40-50 дней норчата опытных и контрольных групп достоверно отличаются по показателям, характеризующим длину и ширину черепа. У особей контрольной группы череп длиннее. У норчат опытной группы более высокие значения имеют показатели ширины черепа (ширина мозгового отдела черепа, межглазичная ширина, ширина заглазничного сужения).

В 86-90-дневном возрасте у особей контрольных и опытных групп прослеживаются общие закономерности развития черепа, которые не зависят от генотипа, половой принадлежности и применения препарата. К ним относятся: возрастание показателей длины, высоты и ширины черепа и в соответствии всех структур, связанных с этим показателем. Увеличивается длина скулового отростка, длина твердого неба, носовых костей и нижней челюсти, высота нижней челюсти, а также показатели ширины (ширина черепа над клыками, межглазичная (межорбитальная) ширина, мастоидная ширина, ширина мозгового отдела). Активная динамика указанных изменений скелета черепа прослеживается у особей всех групп.

Таблица 7

Наиболее выраженные отличия размеров черепа (длина и ширина) у подопытных норок выявлены с наступлением половой зрелости (в 176-180-дневном возрасте). Так у норок опытных групп общая и кондилобазальная длина черепа была достоверно меньше по сравнению с этим показателем у аналогов из контроля соответственно на 3,54%; длина нижней челюсти - на 3,48%; длина твердого неба - на 2,96%; мастоидная ширина - на 3,88%; межглазичная (межорбитальная) ширина - на 4,98%; ширина заглазничного сужения - на 6,83%.

При анатомическом исследовании были установлены отличительные признаки морфогенеза черепа самцов опытной и контрольной групп.

Особенности развития черепа в возрасте 40-50 дней у самцов опытной и контрольной группы сходные и незначительно отличаются от особенностей развития черепа у самок. Но у всех самцов череп был длиннее, чем у самок, имел более развитый затылочный гребень и более широкие глазничные дуги. Особенно это характерно для самцов контрольной группы.

В 86-90-дневном возрасте черепа самцов были более крепкие, мощные с шероховатой поверхностью. Носовая кость имеет границу между лобной и верхнечелюстной костями. Скуловые отростки лобной кости развиты лучше по сравнению с черепами в 40-50-дневном возрасте, притуплены. Наряду с формированием сагиттального гребня, начинает формироваться каудальный вырост лобной кости (глазнично-височный гребень лобной кости или граница между лицевым и мозговым отделом черепа) и вентральный гребень тела затылочной кости. Глазничные дуги широкие, сосцевидные отростки крупные. Клиновидная кость имеет четкие границы. Барабанный пузырь в форме треугольника.

У самцов опытной группы сагиттальный гребень был развит хуже, чем у аналогов из контроля.

В возрасте 176-180 дней черепа самцов всех исследуемых групп были крепкие, мощные, имели менее выраженную шероховатую поверхность по сравнению с предыдущим возрастом. Скуловые отростки лобной кости достигли окончательного развития и были заострены. Каудальный вырост лобной кости (глазнично-височный гребень лобной кости или граница между лицевым и мозговым отделом черепа) просматривается в виде буквы «л». В области небной щели имеются два резцовых отверстия. Граница между пластинкой небной кости и небным отростком верхнечелюстной кости и границы клиновидной кости стерты. Барабанный пузырь конусовидно-округлой формы.

Самцы контрольной группы по сравнению с особями опытной имели более крупный череп, более широкие скуловые дуги и большие по размеру сосцевидные отростки. Затылочный и сагиттальный гребни в этой группе развиты у 80% самцов, а в опытной только у 50% особей. Вентральный гребень тела затылочной кости развит у 60% самцов контрольной группы и у 33% опытной.

Таким образом, представленные краниометрические измерения в совокупности с общими анатомическими исследованиями указывают на существенные отличия морфогенеза черепа американской норки в постнатальном периоде. К факторам, влияющим на развитие черепа, следует отнести возраст, пол, а также абиотический фактор - воздействие Биостила на развивающийся организм норок.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о положительном влиянии препарата на морфогенез черепа самок и самцов американской норки генотипа Standard и некотором угнетающем влиянии Биостила на формирование черепа самок и самцов американской норки генотипа Lavender. Указанные воздействия препарата наиболее выражены в группе самцов репродуктивного периода.

Воздействие препарата на морфогенез черепа особей Lavender (а/а m/m) сопровождается изменением физиологических параметров роста и развития черепа, которые более четко проявляются в репродуктивном периоде и выражаются уменьшением размеров черепа, снижением активности роста дорсального, вентрального затылочного и сагиттального гребней.

В связи с возрастными особенностями развития организма норок оценка влияния препарата наиболее результативна при использовании комплексного метода исследований, который позволяет оценить метрические характеристики (краниометрия) и особенности генеза черепа - общее анатомическое исследование.