Результат интеллектуальной деятельности: Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетическим исследованиям в селекции и пушном звероводстве. Изобретение раскрывает новые генетические маркеры, а именно специфические мутации в генах меланофилина (белок MLPH) и транскрипционного фактора, ассоциированного с микрофтальмией/меланогенезом (белок MITF), а также способ идентификаций генов, вовлеченных в регуляцию формирование окраски меха у американской норки. Авторы изобретения обнаружили, что их функционирование связано с развитием серебристо-голубой (р/р) и белой Хедлюнд (h/h) окрасок меха американской норки (Neovison visori) соответственно. Предложен также способ отбора животных, являющихся носителем какого-либо из указанных маркеров, и применение данного способа в звероводстве для отбора производителей, обладающих генетическими характеристиками, необходимыми для получения потомства желаемой цветовой окраски. Возможность определения наличия или отсутствия данных маркеров в образце ДНК животного методами молекулярной биологии показана на примере их выявления путем проведения ПЦР-анализа и последующего секвенирования биологических образцов американской норки. Раскрыта тест-система, включающая генотипирование животного для выявления у него маркерной полиморфной нуклеотидной вариации, ассоциированной с наличием у животного аллеля, проявляющегося в развитии определенной цветовой вариации. Предложенные в качестве маркеров нуклеотидные вариации в геноме ассоциированы с изменением физиологической активности белков MLPH и MITF-M. Для выявления данных вариаций проводят генотипирование полиморфных локусов в генах MLPH и MITF. В частности, в качестве маркера наличия в генотипе животного аллеля р используют SNP в гене MLPH, и в качестве маркера наличия аллеля h используют SNP в гене MITF.

Цвет окраски меха важен для промышленного разведения норки. Поэтому желательно развивать те популяции норки, которые будут размножаться в соответствии с определенным цветом меха. Тем не менее, создание таких групп особей было бы трудоемким и дорогостоящим с использованием традиционных методов промышленного разведения (тестовых программ). Поэтому желательно уметь определить окраску меха норки на основании генотипа отдельных животных. Авторы изобретения показали, что гены MLPH и MLTF у норки участвует в определении цвета меха. В частности, авторы изобретения впервые обнаружили, что мутация в гене MLPH с. 901+1G>A (р), ответственна за определенный фенотипический признак, а именно - определяет серебристо-голубую (аллели р/р) окраску меха норки, а мутация гена MITF-M с. 33+1G>A (h) определяет белую Хедлюнд (аллели h/h) окраску меха. Авторы изобретения впервые показали ассоциированность физиологической активности белков MITF и MLPH с окраской меха американской норки, что и послужило основой создания нового способа отбора животных, являющих носителями аллелей, обеспечивающих определенную окраску, а также их число. Любые генетические изменения, затрагивающие физиологическую активность генов MITF-M и MLPH, в том числе и внесенные методами геномного редактирования, методами генной инженерии или направленным мутагенезом и другими способами, могут применяться в качестве генетических маркеров для отбора животных, являющихся носителями аллелей желаемой окраски. Авторы раскрывают также референсные последовательности, при сравнении с которыми могут быть выявлены различные новые генетические маркеры, которые могут быть применены для генотипирования животных. В качестве таких маркеров могут быть использованы любые геномные изменения, нарушающие функционирование гена на всех уровнях его функционирования, а также изменения, затрагивающие структуру белка и влияющие таким образом на его физиологическую активность. Раскрыты также два новых маркера, которые могут быть использованы для генотипирования животных с целью выявления животных - носителей аллелей определенных цветовых вариаций.

Открытие мутаций в генах MITF-M и MLPH позволило авторам изобретения разработать методы для различения аллелей Р/р и H/h, таким образом определяя генотип отдельных норок по генам/мутациям, обуславливающим развитие определенных окрасок меха. В соответствии с настоящим изобретением предлагаются способы отбора особей для получения желаемой окраски меха на основе определения генотипа отдельных особей норки.

Эффективность производства меха заданной окраски и разведения соответствующих линий животных может быть повышена, при возможности определения, до скрещивания, является ли животное носителем той или иной мутации, влияющей на окраску меха. Используя данную информацию, селекционер сможет грамотно планировать скрещивания животных, увеличив, таким образом, долю потомства с интересующей его окраской, что в конечном итоге приведет к уменьшению расходов звероводческой организации. В качестве инструмента для отбора животных предложено использовать наличие мутации в гене MLPH с. 901+1G>A, которая в гомозиготном состоянии (р/р) обуславливает развитие серебристо-голубой окраски меха у норки и наличие мутации в гене MITF-M с. 33+1G>A, которая в гомозиготном состоянии (h/h) обуславливает развитие белой Хедлюнд окраски у животного. Данные мутации можно использовать в качестве маркеров, позволяющих определить наличие или отсутствие у животного аллелей р и h (а также их число), обуславливающих исследуемую окраску меха (серебристо-голубую и белую, соответственно).

Изобретение раскрывает также способ селекции и разведения фермерской американской норки по желательному признаку (для получения особей с заданной окраской меха). Способ включает в себя отбор особей, генетически соответствующих по желательному признаку (заданной окраске меха) среди имеющегося поголовья фермерских норок для использования в направленных селекционных программах (получение потомства с заданной окраской меха). Данный способ отбора норок для селекции также может быть использован для защиты от генетической кражи селекционных линий американских норок определенной окраски.

Из всех представителей семейства куньи американская норка (Neovison vison) - наиболее широко распространена, так как является основным объектом клеточного пушного звероводства, на ее долю приходится более 80% международной торговли необработанным мехом [Henning, 2014]. Одна из причин популярности американской норки в пушном звероводстве - чрезвычайно высокое разнообразие окрасочных форм. С 1931 г., когда впервые была описана первая цветовая мутация для американских норок, обусловливающая серебристо-голубую окраску меха, описано и зафиксировано 35 мутаций доминантой, полудоминантной и рецессивной природы, затрагивающих окраску волосяного покрова, на основе которых селекционерами сформировано более 100 комбинативных окрасочных форм [Трапезов и Трапезова, 2009]. Впервые описанная более 80 лет назад, мутация, обуславливающая серебристо-голубую окраску меха (наследующуюся как моногенный аутосомно-рецессивный признак, обозначаемый как р/р), с течением времени стала чрезвычайно популярной, и в сейчас она является одной из наиболее часто используемых мутаций в меховой промышленности норки. В сочетании с другими мутациями она участвует в формировании наиболее популярных окрасок меха, таких как фиолетовая (а/а m/m р/р), сапфир (а/а р/р), жемчуг (k/k р/р или а/а k/k р/р) и другие [Трапезов и Трапезова, 2009; Cirera et al., 2013].

Другой популярной окраской меха у американской норки является белая окраска. Описано по меньшей мере две мутации, приводящей к формированию белой окраски меха у норки. Она из них является классической альбино-окраской, так же известной как королевская белая окраска, данная окраска наследуется как моногенный аутосомно-рецессивный признак (обозначается как с/с) и обуславливается мутацией в гене (TYR) [Anistoroaei et al., 2008]. Вторая белая окраска меха - белый Хедлюнд (h/h) отличается от альбино-формы окраской глаз, у белых Хедлюнд норок глаза темные, в то время как у альбиносов - красные. Окраска белый Хедлюнд наследуется как моногенный кодоминантный признак - гомозиготы h/h имеют белую окраску и часто являются глухими, а гетерозиготы H/h - имеют пятнистую, пегую окраску и нормальный слух [Markakis et al., 2014]. Белый мех востребован на рынке, так как легко может быть покрашен [Anistoroaei et al., 2008].

В настоящее время с молекулярно-генетической точки зрения описано всего лишь 4 из более чем 30 мутаций, обуславливающих формирование цветных форм американкой норки. Это мутации, обуславливающие королевскую белую (с/с), гималайскую (c^h/c^h), алеутскую (а/а) окраски, а также окраску американский паломино (k/k) [Anistoroaei et al., 2008; Benkel et al., 2009; Anistoroaei et al., 2013; Cirera et al., 2016]. В случае, если генетические маркеры животных-носителей данных мутаций неизвестны, носительство определяют, используя генеалогический метод - это метод изучения родословных, с помощью которого прослеживается наследование признака в группе с указанием типа родственных связей между членами родословной. Молекулярно-генетический маркеры для животных, являющихся носителями признака «белый Хедлюнд» и «серебристо-голубая» до настоящего времени не были известны и впервые предложены в заявленном изобретении.

Авторы изобретения провели полногеномное секвенирование и последующее сравнение геномов американских норок, характеризующихся тремя различными окрасками: стандартной темно-коричневой (дикий тип, +/+), серебристо-голубой (аллели р/р) и белой Хедлюнд (аллели h/h). У животных с серебристо-голубой и белой Хедлюнд окрасками были обнаружены изменения в структуре белок-кодирующих транскриптов генов MLPH и MITF, которые приводят к продукции нефункциональных белков MLPH и

MITF-M соответственно. В результате проведенных экспериментов, авторы изобретения, выявили у норок с серебристо-голубой окраской меха мутацию с. 901+1G>А в гене MLPH, ранее не описанную для животных с такой окраской, и убедительно доказали, что данная мутация приводит к серьезным нарушениям в структуре транскрипта гена MPLH (полня потеря 7-го экзона, длиной 196 п.н.). На расширенной выборке животных авторами изобретения было продемонстрированно, что мутация MLPH с. 901+1G>А в гомозиготном состоянии встречается только у животных серебристо-голубой окраски или животных с комбинантными окрасками, в формировании которых задействован локус р, что является доказательством того, что мутация с. 901+1G>A в гене MLPH обуславливает развитие серебристо-голубой окраски у животных, гомозиготных по данной мутации (аллели р/р).

Данная мутация никогда не была описана у животных с серебристо-голубой окраской меха ранее, а также не была связана с развитием данного типа окраски меха. Следует отметить, что хотя ранее в работе Cirera S. et al, 2013 была показана взаимосвязь между геном MLPH и формированием серебристо-голубой окраски меха и была выявлена крупная делеция в данном гене, предложенная авторами статьи для генетического тестирования норок с серебристо-голубой окраской меха, однако ассоциаций для конкретного определенного полиморфного варианта гена MLPH, а именно для мутации с. 901+1G>A с серебристо-голубой окраской меха выявлено не было. Таким образом, авторы изобретения выявили новый генетический вариант гена MLPH, обуславливающий развитие определенного фенотипического признака у норки - серебристо-голубую цветовую окраску шерсти.

Также авторами изобретения впервые была выявлена мутация MITF-M с. 33+1G>A в гене MITF, которая обуславливает развитие белой Хедлюнд (h/h) окраски. Ранее Markakis M.N. et al. 2014 изучали влияние гена MITF на формирование белой Хедлюнд (h/h) окраски меха у американской норки, однако, при анализе кодирующей области данного гена Markakis M.N с соавторами не сумели выявить мутаций, потенциально обуславливающих формирование данной окраски, о чем они прямо заявляют в своей работе. В ходе проведенных экспериментов, авторы данного изобретения убедительно доказали, что окраска белый Хедлюнд у американской норки обуславливается мутаций MITF-M с. 33+1G>A. Было показано, что мутация MITF-M с. 33+1G>A приводит к нарушению сплайсинга меланоцито-специфичной изоформы гена MITF, являющейся важным регулятором процессов развития и выживания меланоцитов. На расширенной выборке животных авторами заявки продемонстрировано, что мутация MITF-M с. 33+1G>A в гомозиготном состоянии встречается только у животных белой Хедлюнд окраски, и не выявлена в гомозиготном состоянии ни у одного из животных с окраской меха дикого типа или другим типом окраски. Таким образом, авторы изобретения выявили новый генетический вариант гена MITF-M, обуславливающий развитие определенного фенотипического признака у норки - белой Хедлюнд окраски шерсти.

Таким образом, данное изобретение относится, прежде всего, к использованию обнаруженных мутаций в генах MLPH и MITF в качестве молекулярно-генетических маркеров, позволяющих определить наличие или отсутствие у животного аллелей р и h (а также их число). Изобретение относится также к способу проведения этого определения, который основан на проведении следующих стадий:

1) взятие пробы геномной ДНК от американской норки;

2) исследование геномной ДНК, полученной на стадии (1), для определения, наличия или отсутствия у животного аллелей р и h (а также их числа)

Соответственно, стадия (2), а именно - определение, наличия или отсутствия у животного аллелей р и h (а также их числа), осуществляются путем проведения генотипирования по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A Причем специалисту понятно, что для осуществления генотипирования по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A может быть использован любой известный в настоящее время способ определения нуклеотидной последовательности ДНК и\или наличия определенной мутации (секвенирование по Сэнгену, NGS, аллельспецифичная ПЦР, ПЦР-ПДРФ, TaqMan Real-Time PCR и др.). Изобретение относится к способу отбора особей норки, пригодных в племенной работе для получения желаемой окраски меха. Изобретение относится также к референсным последовательностям генов MLPH и MITF, любые изменения в которых, приводящие к изменению функционирования кодируемых ими белков, а также уровня их продукции, могут быть использованы в качестве генетических маркеров носительства аллелей (а также их числа), ассоциированных с определенной окраской меха. Изобретение относится также к мутации в гене MLPH, которая приводит к нарушению структуры мРНК MLPH и, как следствие, к продукции укороченного белка и развитию серебристо-голубой окраски меха.

Изобретение относится также к способу выявления особи американской норки, являющейся носителем не менее чем одного аллеля, обуславливающего формирование вариации белой Хедлюнд, включающего генотипирование животного для выявления у него маркерного SNP, представляющего собой MITF (MITF-M с. 33+1G>A), наличие которого является маркером проявления белой Хедлюнд окраски у животного, гомозиготного по h-аллелю (h/h) и пятнистой/пегой окраски у животного в гетерозиготного по h-аллелю (h/+).

Референсные нуклеотидные последовательности, сравнение с которыми может привести к обнаружению мутаций, ассоциированных с окраской меха у американской норки:

1) SEQ ID NO: 1: частичная последовательность гена MLPH: CCTCCAGAAGAGCAGATGGACAGCCTCTCCCCTGTGGGACAGGACACCCTCACTGAGCTCTGCGTCCCTGGAGAGTCCCGCAGGACAGCCCTGGGGACTGCTGCTGCAGCTGGTAGGTCCCTTGATGGGCTCTGCATTGGGGAAGGGGTCAGCAGAAAACCCACCCACTGCCCTGATTTGTGCAGACACGCCGGCCGATTGATAGCAACCCCTTCCTTCACCGCCTTGTCTGGCATGTCTGGTCCTGGTAGACACCACTCCCCACCCACTGCCCCCCACCCCCAGGCTGGGTGCTGCCGTCCTGACACTCAGAAGTCCCAGCATCAATAGCTC;

2) SEQ ID NO: 2: частичная последовательность гена MITF-M: CTTCTCTATGCCCGTCAGTCTTTGAACTGGAATTACAGAAAGTAGAGAGAGTGAATAGTCTACCGTTTCTCTCGTTGGACTGGGGCCACCTAAAACGTTGTTATGCTGGAAATGCTAGAATACAATCACTATCAGGTGAGCTTTATTCTTATTCATATGCAGTGTCTGAAATGTAATGCAGTGAATTGAGTAATTTGCCTTTTCATGTTATTGTACTCTTTCCAATAAGTGCAGGTCTACTAGTTTAATACTGTTTACTGTTTGATACCGTAAGAGGTAATTCAATGTGGTTTTGAACAAAGTAAATATAGTAGGGTATTTTTTTTTTCCCTAGTGCCTGGCTGTGCTCTCTCCATCAGCTCCTGTTC.

В настоящее время аналогов представляемым маркерам и способу их использования для определения окраски меха у американской норки не существует.

Для осуществления генотипирования по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A может быть использован любой известный в настоящее время стандартный метод для определения наличия конкретной нуклеотидной последовательности ДНК и\или наличия определенной мутации (секвенирование по Сэнгену, NGS, аллельспецифичная ПЦР, ПЦР-ПДРФ, TaqMan Real-Time PCR и др.). В качестве одного из примеров генотипирования авторами приводится метод с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Таким образом, предпочтительный аспект изобретения включает в себя этап, на котором определение того, присутствует ли полиморфизм (ы) в нуклеотидных последовательностях MLPH и MITF-M, включает амплификацию ДНК в присутствии олигонуклеотидных праймеров, выбранных из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 для гена MLPH и SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 для гена MITF-M (таблица 2).

Последостальености праймеров, используемых в ПЦР, представлены в Таблице 2.

Ниже представлены примеры проведения генотипирования животных по мутациям MLPH с. 901+1G>A и MITF-M с. 33+1G>A, а также применение данного способа в селекции.

Пример 1. Генотипирование биологического образца.

Получение ДНК

ДНК может быть получена из любой исходной ткани животного, содержащей клеточные ядра, например, лейкоцитов, волосяных фолликулов, ткани уха и мышечной ткани, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образа при помощи наборов QIAamp DNA Mini Kit компании Qiagen (www.qiagen.com). Однако любой метод выделения ДНК должен быть в равной степени эффективным.

Амплификация участков генома американской норки, содержащих исследуемые мутации

Может быть осуществлена с помощью наборов GenPack PCR Core компании «Изоген», на приборах GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems» по следующей программе: 94°C - 5 мин; (94°C - 30 сек; 58°C - 30 сек; 72°C -30 сек) * 35 циклов; 72°C - 10 мин. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 10 мкл PCR Diluent, по 0,5 пмоль прямого и обратного праймеров (Таблица 2), 10 нг геномной ДНК.

Секвенирование полученных ПЦР продуктов

Полученные в результате ПЦР фрагменты очищали с использованием наборов Cleanup компании «Евроген».

Сиквенсную реакцию проводили с помощью набора реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit компании «Applied Biosystems», реакционная смесь объемом 10 мкл содержала: 2 мкл BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 1 мкл BigDye™ Terminator v3.1 5X Sequencing Buffer, 0,1 пмоль прямого или обратного праймер (Таблица 2), и очищенный ПЦР продукт.

Полученные продукты реакции очищали на колонках DyeEx 2.0 Spin Kit («Qiagen») и секвенировали на приборе ABI PSISN 3730x1 компании «Applied Biosystems».

Анализ полученных нуклеотидных последовательностей

Проводили с использованием программ Chromas, GeneDoc и веб-сервиса Clustal Omega.

Проводили выравнивание и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей, исследуемых особей с нуклеотидной последовательность норки стандартной, темно-коричневой (+/+), окраски (Таблица 1).

Пример 2. Способ отбора особей норки для получения у потомства окраски

Серебристо-голубая:

Зная исходные генотипы животных, возможно предсказать долю потомства с желаемой окраской.

Условные обозначения:

Аллель Р - MLPH с. 901+1G

Аллель р - MLPH с. 901+1А

Для выведения животных с серебристо-голубой окраской меха необходимо, чтобы оба производителя были:

1) гомозиготами рр, тогда 100% потомства будет иметь серебристо-голубую окраску меха;

2) гетерозиготами Рр, тогда 25% потомства будет иметь серебристо-голубую окраску меха (рр), 75% стандартную окраску (РР/Рр)

3) гомозиготой рр и гетерозиготой Рр, тогда 50% потомства будет иметь серебристо-голубую окраску меха (рр), а 50% стандартную окраску (Рр).

Следует отметить, что, в случае, если скрещиваемые организмы являются носителями других мутаций, оказывающих влияние на окраску меха (например, мутации LYST c. 9468delC, обуславливающей алеутскую окраску меха (a)) [Anistoroaei et al., 2013] то окраски меха животных потомства от таких скрещиваний могут отличаться от выше описанных за счет формирования комбинационных окрасок меха (например, сапфир (аа pp)).

Пример 3. Способ отбора особей норки для получения белой Хедлюнд окраски.

Зная исходные генотипы животных возможно предсказать долю потомства с желаемой окраской.

Условные обозначения:

Н - MITF-M с. 33+1G

h - MITF-M с. 33+1А

Для выведения животных с белой Хедлюнд окраской необходимо, чтобы оба производителя были:

1) гомозиготами hh, тогда 100% потомства будет иметь белую Хедлюнд окраску меха;

2) гетерозиготами Hh, тогда 25% потомства будет иметь белую Хедлюнд окраску меха (hh), 50% будут иметь стандартную окраску с белыми пятнами (пегость) (Hh), 25% будут иметь стандартную окраску;

3) гомозиготой hh и гетерозиготой Hh, тогда 50% потомства будет иметь белую Хедлюнд окраску меха (рр), а 50% будут иметь стандартную окраску с белыми пятнами (пегость) (Hh).

Пример 4. Применение способа в селекционной работе. Условные обозначения:

Р - MLPH с. 901+1G

р - MLPH с. 901+1А

Предположим, имеется популяция норок стандартной темно-коричневой окраски. В результате проведенного генотипирования по мутации MLPH с. 901+1G>A было выяснено, что 50% популяции гомозиготы по аллелю MLPH с. 901+1G (РР), а 50% популяции гетерозиготы по аллелю MLPH с. 901+1А (Рр).

1) В случае случайного скрещивания в потомстве ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:

93,75% стандартных темно-коричневых животных (56,25% РР+37,50% Рр)

6,25% серебристо-голубых животных (рр)

2) В случае целенаправленного скрещивания животных с генотипом Рр в потомстве от таких скрещиваний ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:

50% стандартных темно-коричневых животных (Рр)

50% серебристо-голубых животных (рр)

Таким образом, применение предложенного способа определения окраски меха американской норки, с использованием молекулярных маркеров ДНК, может существенно увеличить долю животных с заданной окраской в потомстве.

>Neovison vison MPLH (часть)

CCTCCAGAAGAGCAGATGGACAGCCTCTCCCCTGTGGGACAGGACACCCTCACTGAGCTCTGCGTCCCTGGAGAGTCCCGCAGGACAGCCCTGGGGACTGCTGCTGCAGCTGGTAGGTCCCTTGATGGGCTCTGCATTGGGGAAGGGGTCAGCAGAAAACCCACCCACTGCCCTGATTTGTGCAGACACGCCGGCCAATTGATAGCAACCCCTTCCTTCACCGCCTTGTCTGGCATGTCTGGTCCTGGTAGACACCACTccccacccactgccccccacccccaGGCTGGGTGCTGCCGTCCTGACACTCAGAAGTCCCAGCATCAATAGCTC

>Neovison vison MITF (часть)

CTTCTCTATGCCCGTCAGTCTTTGAACTGGAATTACAGAAAGTAGAGAGAGTGAATAGTCTACCGTTTCTCTCGTTGGACTGGGGCCACCTAAAACGTTGTTATGCTGGAAATGCTAGAATACAATCACTATCAGGTGAGCTTTATTCTTATTCATATGCAGTGTCTGAAATGTAATGCAGTGAATTGAGTAATTTGCCTTTTCATGTTATTGTACCCTTTCCAATAAGTGCAGGTCTACTAGTTTAATACTGTTTACTGTTTGATACCGTAAGAGGTAATTCAATGTGGTTTTGAACAAAGTAAATATAGTAGGGTAttttttttttCCCTAGTGCCTGGCTGTGCTCTCTCCATCAGCTCCTGTTC

>S-b_dir

CCTCCAGAAGAGCAGATGG

>S-b_rev

GAGCTATTGATGCTGGGACT

>WH_dir

CTTCTCTATGCCCGTCAGTC

>WH_rev

GAACAGGAGCTGATGGAGAG