СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЗМА К ХРОНИЧЕСКОМУ КОМБИНИРОВАННОМУ ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА НИКЕЛЯ И ОКСИДА МАРГАНЦА

Изобретение относится к медицине, в частности к токсикологии наночастиц (нанотоксикологии), и может быть использовано для снижения неблагоприятных эффектов комбинированного действия наночастиц оксидов никеля и марганца на организм в группах риска, охватывающих лиц, которые подвергаются такому воздействию в производственных условиях, в частности в электросварочном и в металлургическом производствах.

Опубликованы работы, в которых различными тестами и на различных биологических объектах демонстрируется высокое цитотоксическое, системно-токсическое и генотоксическое действие никельсодержащих, преимущественно NiO, наночастиц (Zhang Q, Yukinori К, Zhu X, et al. Comparative toxicity of standard nickel and ultrafine nickel after intratracheal instillation. J Occip Health. 2003; 45:23-30 [1]; Magaye R, Zhao J. Recent progress in studies of metallic nickel and nickel-based nanoparticles′ genotoxicity and carcinogenicity. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2012; 34(3): 644-650 [2]; Magaye R, Zhao J, Bowman L, Ding M. Genotoxicity and carcinogenicity of cobalt-, nickel- and copper-based nanoparticles. Exp Ther Med. 2012; 4:551-561 [3]; MorimotoY, Hirohashi M, Ogami A, et al. Pulmonary toxicity following an intratracheal instillation of nickel oxide nanoparticle agglomerates. Journal of Occupational Health. 2011; 53(4):293-295 [4]; Capasso L, Camatini M, Gualtieri M. Nickel oxide nanoparticles induce inflammation and genotoxic effect in lung epithelial cells. Toxicol Lett. 2014; 226(1):28-34 [5]).

Высокое цитотоксическое, системно-токсическое и генотоксическое действие марганецсодержащих наночастиц, преимущественно состоящих из МnO₂ или Мn₃O₄, также известно (Saber M. Hussain SM, Javorina AK, et al. The Interaction of Manganese Nanoparticles with PC-12 Cells Induces Dopamine Depletion. Tox Sciences. 2006; 92(2):456-463 [6]; Singh SP, Kumari M, Kumari SI, Rahman MF, Mahboob M, Grover P. Toxicity assessment of manganese oxide micro and nanoparticles in Wistar rats after 28 days of repeated oral exposure. J Appl Toxicol. 2013; 33(10):1165-1179 [7]; Bellusci M, La Barbera A, Padella F, et al Biodistribution and acute toxicity of a nanofluid containing manganese iron oxide nanoparticles produced by a mechanochemical process. International J of Nanomedicine. 2014; 9:1919-1929 [8]. Однако ни примеров изучения хронической комбинированной системной токсичности оксидов никеля и марганца в форме наночастиц, ни испытания или хотя бы теоретического обоснования средств биологической защиты от вредных эффектов длительного комбинированного воздействия на организм этих наночастиц информационный поиск не обнаружил.

С практических позиций профилактической токсикологии и оценки рисков для здоровья рабочих существенно то, что органо-системная токсичность (в том числе, поражение печени, селезенки, почек и головного мозга), а также генотоксичность наночастиц оксидов никеля, марганца и их комбинации «ин виво» наблюдаются, как показывает опыт заявителя, при низком уровне экспериментальных экспозиций к ним. Это говорит о том, что снижение реальных производственных экспозиций до надежно безвредных уровней труднодостижимо.

Поэтому задачей изобретения является создание способа защиты, основанного на повышении устойчивости организма к вредным эффектам комбинированного действия наночастиц оксидов никеля и марганца. В результате решения этой задачи разработан способ профилактики вредных эффектов органо-системного уровня, обусловленных комбинированным хроническим общетоксическим и генотоксическим действием наночастиц оксидов никеля и марганца на организм. Он заключается в том, что лицам, относящимся к группе риска этого действия, назначают комплекс биологически активных препаратов, включающий в себя глютаминовую кислоту, глицин, цистеин, пектиновый энтеросорбент, препарат рыбьего жира, богатый неэстерифицированными жирными кислотами класса омега-3, а также витамины А, С, Е, селен- и йодсодержащие препараты, причем лица группы риска принимают этот комплекса повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6-недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение в день 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глютаминовой кислоты, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием полиненасыщенных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, а также селен, йод и указанные витамины в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма.

Входящие в комплекс аминокислоты, а именно глютамат, глицин и цистеин, включены в него как предшественники биосинтеза восстановленного глютатиона, который является системным протектором от оксидативного и свободно-радикального повреждения клетки и субклеточных структур, характеризующего первичные механизмы цитотоксичности и генотоксичности различных металлосодержащих наночастиц, притом, что глютамат является еще и мощным стабилизатором клеточных мембран, а также важнейшим нейромедиатором центральной нервной системы, специфически повреждаемой марганцем.

Важная роль оксидативного стресса, как одного из механизмов вредного совместного действия рассматриваемых наночастиц, объясняет включение в число биопротекторов также других активных естественных био-антиоксидантов, а именно селена и витаминов А, Ε и С. Включение йода в биопротекторый комлекс обусловлено тем, что марганцевая интоксикация сопровождается нарушениями функции щитовидной железы, тесно связанной с этим био-микроэлементом.

Пектиновый энтеросорбент в заявленном комплексе предназначен для блокирования кишечной абсорбции ионов металлов, образующихся при раствореинии наночастиц, перенесенных в желудочно-кишечный тракт после отложения в дыхательных путях, а также реабсорбции ионов, выделенных печенью с желчью.

Заявленный комплекс содержит также препарат рыбьего жира, богатый полиненасыщенными жирными кислотами класса омега-3, внутриклеточными производными которых являются эйкозаноиды, активирующие репликацию ДНК, тем самым играя важную роль в репарации ее повреждений.

То, что лицам группы риска рекомендовано принимать препараты комплекса повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6-недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение в день 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глютаминовой кислоты, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием полиненасыщенных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, обосновано пересчетом содержания перечисленных активных факторов (биопротекторов) в биопрофилактическом комплексе (БПК), защитная эффективность которого доказана в эксперименте, проведенном на лабораторных белых крысах. Пересчет в указанные дозы для человеческого применения осуществлен на основе соотношения уровней основного обмена крысы и человека с учетом также справочных и литературных данных о суточной потребности человека в этих факторах. Дозы био-микроэлементов (селена и йода) и витаминов обусловлены не таким пересчетом, а нормальными физиологическими потребностями организма, включая компенсацию эндогенной витаминной недостаточности и микроэлементного дисбаланса, возникающих при интоксикации.

Механизмы защитного действия входящих в комплекс биопротекторов сложны и, по-видимому, взаимно потенцируют друг друга. Важное значение могут иметь: (а) разное по молекулярным механизмам противорадикальное (в том числе, антиоксидантное) действие, в той или иной степени присущее ряду биопротекторов заявляемого комплекса (антиоксидантный синергизм); (б) мембрано-стабилизирующее действие глютамата, поскольку оно может препятствовать повреждению митохондрий наночастицами оксидов металлов и тем самым оксидативному стрессу, являющемуся, по современным представлениям одним из основных механизмов цитотоксического и генотоксического действия металлических наночастиц (, Ε. Cellular targets and mechanisms in the cytotoxic action of non-biodegradable engineered nanoparticles. J. Curr. Drug. Metab. 2013, 14, 976-988) [9]; (в) компенсация некоторых функциональных и биохимических нарушений, связанных с токсикодинамическими механизмами, как общего характера, так и специфичных для конкретного вида наночастиц.

Характерной особенностью заявленного способа является комплексное использование всех вышеперечисленных механизмов. Впервые показано, что на фоне перорального назначения предложенной комбинации препаратов (биопротекторов) хроническая системная токсичность и генотоксичность наночастиц оксидов никеля и марганца, воздействующих на организм совместно, могут быть существенно ослаблены. В результате поиска по источникам научно-технической и патентной литературы не выявлены средства, направленные на решение такой задачи. Новый технический результат, достигаемый изобретением, заключается в снижении вредных эффектов токсического и генотоксического комбинированного действия наночастиц оксидов никеля и марганца на организм.

Заявленный способ экспериментально опробован на аутбредных белых крысах-самках с начальным весом тела 150-220 г. Животные содержались в условиях специально организованного вивария, соответствующих ветеринарным требованиям. В питье они получали артезианскую воду, очищенную до первой категории качества, в пищу - полнорационный комбикорм ООО «Лабораторкорм». Суспензии наночастиц изготавливалась методом лазерной абляции соответствующих чистых (99,99%) металлов в деионизированной воде с помощью лазерной системы для обработки материалов Fmark-20 RL (ЦЛТ, Россия). Химический состав наночастиц определялся методом Рамановской спектроскопии и был идентифицирован как NiO и Мn₃O₄.

Характеристика распределения размеров наночастиц давалась их прямым измерением при сканирующей электронной микроскопии и методом динамического рассеяния света с помощью анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Частицы имели сферическую форму со средним диаметр (±σ) 16.7±8.2 нм для NiO и 18.4±5.4 нм для Мn₃O₄. Для каждого введения животным использовались свежеприготовленные суспензии.

Водные суспензии наночастиц с концентрацией 0,5 мг/мл вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 1 мг на крысу (приблизительно 5 мг/кг массы тела) 18 раз по 3 раза в неделю. Во избежание прямого взаимодействия оксидов, ускоряющего агломерацию наночастиц, суспензии NiO и Мn₃O₄ набирались в отдельные шприцы и вводились раздельно с интервалом около 1 мин. Контрольным животным аналогичным образом вводили соответствующей объем той же стерильной деионизированной воды, на которой готовились суспензии. Отдельные группы животных получали те же инъекции на фоне перорального приема биопрофилактического комплекса (БПК). Введение наночастиц и умерщвление животных разных групп проводились параллельно.

Препараты, содержащие вышеперечисленные биопротекторы, давались тем способом и в тех дозировках, которые приведены в таблице 1. Цистеин включен в комплекс в метаболически активной форме N-ацетилцистеина.

Состояние организма крыс во всех группах оценивалось по большому числу (свыше 50) общепризнанных функциональных, биохимических и морфологических (с морфометрией) критериев токсического действия. Для оценки генотоксического действия наночастиц «ин виво» использовали ПДАФ анализ (ПДАФ - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК), причем для характеристики степени повреждения ДНК использовали «коэффициент фрагментации», то есть отношение суммарной радиоактивности всех фракций «хвоста» к радиоактивности «ядра» кометы.

В таблице 2 приведены только те функциональные показатели состояния организма, по которым при действии комбинации наночастиц оксидов никеля и марганца были выявлены неблагоприятные сдвиги по сравнению с контрольными величинами, причем статистически значимо ослабленные на фоне действия БПК. Наряду с этим, еще по большому числу показателей (в частности, свидетельствующих о развитии анемии), вызываемые наночастицами сдвиги были на фоне БПК ослаблены с потерей статистической значимости отличия величины от контрольной. Ни один из 52 функциональных показателей интоксикации не был под влиянием БПК усилен. Наряду с ослаблением ее развития отмечено значимое снижение генотоксического эффекта, оцененного по коэффициенту фрагментации геномной ДНК лейкоцитов крови.

Гистологическое изучение тканей печени, почек, селезенки и головного мозга, сочетавшееся с морфометрией, выявило у крыс, подвергавшихся комбинированному воздействию наночастиц оксидов никеля и марганца, ряд выраженных патологических изменений, существенно ослабленных при том же воздействии на фоне приема БПК, причем этот благоприятный эффект БПК подтвержден количественными (морфометрическими) показателями, приведенными в таблицах 3-5.

На фиг. 1 представлены микрофотографии гистологических препаратов почек (окраска ШИК, увеличение x400) крыс из контрольной группы с нормальной структурой извитых канальцев; на фиг. 2 - то же из группы, подвергавшейся затравке наночастицами NiO+Mn₃O₄, при которой видны выраженные дегенеративные некробиотические изменения клеток канальцевого эпителия вплоть до полной их десквамации, частичное разрушение щеточной каемки, расширение просвета канальцев; на фиг. 3 - то же из группы, подвергавшейся затравке наночастицами NiO+Mn₃O₄ на фоне приема БПК, при которой гистологическая картина мало отличается от нормальной.

На фиг. 4 представлены микрофотографии гистологических препаратов головного мозга в зоне CAI гиппокампа (окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400) крыс из контрольной группы с нормальной структурой этой зоны; на фиг. 5 - то же из группы, подвергавшейся затравке наночастицами NiO+Mn₃O₄, при которой видны многие нейроны с выраженными дегенеративными изменениями или пикнозом, а также со смещением или полным исчезновение ядрышка; на фиг. 6 - то же из группы, подвергавшейся затравке наночастицами NiO+Mn₃O₄ на фоне приема БПК, при которой гистологическая картина гиппокампа мало отличается от нормальной. Аналогичные явления обнаружены в хвостатом ядре полосатого тела. Этим изменениям придается особое значение, поскольку поражение базальных ядер и гиппокампа характерно для профессионального марганцевого паркинсонизма у людей.

Сопоставление полученных данных с литературными свидетельствует о том, что впервые в токсикологическом эксперименте на целостном организме убедительно продемонстрированы наряду с большим числом интегральных признаков хронической интоксикации гепатотоксичность, нефротоксичность и специфическая нейротоксичность комбинации наночастиц оксидов никеля и марганца, а также ее генотоксичность. При этом показано, что при использовании заявленного способа все эти вредные эффекты ослаблены или даже полностью предупреждены.