Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СУСПЕНЗИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В ЭТАНОЛ-УКСУСНОМ ФИКСАТОРЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано при проведении медико-биологических исследований.

Анализ ДНК как носителя генетической информации играет ключевую роль в ряде биологических и медицинских исследований. В практике медико-биологических исследований используются разнообразные источники нуклеиновых кислот (НК): от эпителиальных соскобов до сухих пятен крови и постоянных препаратов тканей человека [1]. При этом выделение ДНК из фиксированных образцов тканей является затруднительным. Так, при обработке клеток этанол-уксусным или метанол-уксусным фиксатором происходит обезвоживание биологического материала, денатурация макромолекул и снижение их растворимости, вследствие чего становится невозможным или сильно затрудняется переход нуклеиновых кислот в водные растворы.

Несмотря на большое разнообразие протоколов для выделения НК до сих пор нет унифицированной схемы получения препаратов ДНК из фиксированных лимфоцитов человека. Вместе с тем данный вид биологического материала в ряде случаев является единственным потенциальным источником ДНК. Так, в практической деятельности цитогенетических лабораторий, как научных, так и клинических, фиксированные лимфоциты используются для приготовления препаратов хромосом и являются коллекционным материалом [2]. При необходимости ретроспективного анализа образцы такой коллекции могут быть использованы для получения и дальнейшего анализа нуклеиновых кислот.

В качестве аналога принят способ выделения ДНК из жидких сред человека [3]. Метод основан на лизисе клеточных элементов хаотропным агентом гуанидин тиоцианатом (GuSCN) с одновременным связыванием высвобождающихся НК сорбентом на основе кремнезема или диатомита. В дальнейшем сорбент, содержащий ДНК, освобождается от примесей в ходе последовательных промывок с помощью буфера с GuSCN, 70% раствора этанола и, наконец, ацетона. Сорбент высушивается, а на последней стадии связанная ДНК элюируется в ТЕ-буфер.

Наиболее технологически близким данному аналогу и заявленному изобретению является известный способ выделения НК, заявленный в патенте №2272072 «Способ выделения нуклеиновых кислот» [4]. Известный способ выделения нуклеиновых кислот включает смешивание образца с буферным раствором, содержащим хаотропный агент, адсорбцию нуклеиновых кислот на стекловолокнистом сорбенте, промывку его от примесей ненуклеотидной природы и элюцию нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что сорбент предварительно обрабатывают 0,1-7,0% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 ч.

Данный способ принят за прототип. В заявленной модификации в качестве носителя НК используется стекловолокнистый сорбент, а для избирательного выделения НК различных типов применяют буферные растворы, содержащие в различном соотношении GuSCN, ЭДТА и трис-ацетат. Отделение сорбента от жидкой фазы осуществляют под давлением, вакуумом или центрифугированием, а элюцию НК проводят буферным раствором с ионами бикарбоната и ЭДТА или дистиллированной водой.

Общим недостатком перечисленных выше аналога и прототипа является невозможность их непосредственного использования для выделения НК из фиксированных клеток и тканей человека из-за высокого содержания в последних денатурирующих веществ. Существенно также, что для выполнения этих технологий в лабораторных условиях используется ряд редких и дорогостоящих реагентов, некоторые из которых требуют особых условий хранения и эксплуатации. Необходимость самостоятельного приготовления рабочих растворов и материалов из них сильно затрудняет стандартизацию методик и, как следствие, может негативно повлиять на качественные и количественные характеристики конечного продукта. Все это делает неприемлемым применение предлагаемых подходов в ряде лабораторий.

Технической задачей изобретения является получение ДНК из лимфоцитов человека, прошедших обработку этанол-уксусным фиксатором, с сохранением качественных и количественных характеристик образца, приемлемых для дальнейшего проведения полимеразной цепной реакции.

Термин «полимеразная цепная реакция» по тексту далее используется в сокращенном виде ПЦР.

В предлагаемом изобретении этот технический результат достигается дополнительной стадией пробоподготовки, при которой фиксатор заменяется физиологическим раствором, представляющим собой 0,9% раствор NaCl, и последующим выделением ДНК сорбентным способом. Технология должна отвечать требованиям безопасности, простоты и высокой надежности, что достигается использованием готовых коммерческих реагентов и материалов, прошедших сертификацию.

Предлагается способ подготовки суспензии лимфоцитов человека в этанол-уксусном фиксаторе для выделения ДНК путем центрифугирования указанной суспензии, удаления надосадочной жидкости, высушивания полученного препарата в течение 5 мин при температуре 55°С, после чего добавляют физиологический раствор.

Заявленный способ включает следующие последовательные стадии:

1. Суспензию лимфоцитов в этанол-уксусном фиксаторе (3:1) в объеме 10 мл помещают в центрифужные пробирки на 15 мл и центрифугируют 10 минут при 1200 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют до объема 1 мл.

2. Осадок ресуспендируют, переносят обогащенную лимфоцитами суспензию в чистые микропробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируют микропробирки 10 минут при 10000 об/мин. Полностью удаляют надосадочную жидкость.

3. Размещают микропробирки с открытыми крышками на предварительно прогретом до 55°С твердотельном термостате. Высушивают препарат в течение 5 минут.

4. К подсушенному осадку лимфоцитов добавляют 100 мкл физиологического раствора, тщательно ресуспендируют.

5. К полученной суспензии добавляют 300 мкл коммерческого лизирующего реагента. Термостатируют пробирку 5 минут при 65°С.

6. Добавляют в пробирку 20 мкл суспензии сорбента. Пробирку встряхивают на вортексе 10 секунд, а затем центрифугируют 15 секунд при 5000 об/мин.

7. Супернатант удаляют, к осажденному сорбенту добавляют 1,0 мл спиртово-солевого буфера и интенсивно перемешивают.

8. Центрифугируют пробирку 15 секунд при 5000 об/мин.

9. Повторяют промывку сорбента спиртово-солевым буфером согласно п. 7. Центрифугируют пробирку 15 секунд при 10000 об/мин.

10. Удаляют супернатант, осадок подсушивают при 65°С 5 минут.

11. К подсушенному сорбенту добавляют 100 мкл дистиллированной воды, ТЕ-буфера или иного водного элюента.

12. Суспендируют содержимое пробирки на вортексе 10 секунд, после чего пробирку термостатируют при 65°С 5 минут. Повторно суспендируют содержимое пробирки на вортексе.

13. Центрифугируют пробирку 1 минуту при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК, переносят в чистую пробирку.

Сущность предлагаемого способа и полученные результаты поясняются на фиг. 1, фиг. 2 и фиг. 3. На фиг. 1 показаны результаты измерения концентрации ДНК, выделенной из ряда образцов фиксированных лимфоцитов заявляемым способом, на фиг. 2 - результаты измерения соотношения 260/280 в полученных препаратах ДНК, выделенной заявляемым способом, на фиг. 3 - электрофореграмма продуктов ПЦР, проведенной с использованием ДНК, выделенной заявляемым способом.

На фиг. 1 представлены результаты спектрофотометрического определения концентрации ДНК, подтверждающие осуществление заявленного способа. Выделение ДНК проводили из 43 образцов лимфоцитов в этанол-уксусном фиксаторе. Замеры осуществляли на приборе NanoDrop 2000 с помощью программного обеспечения разработчика оборудования (Thermo Fisher Scientific Inc.) путем определения поглощения образцом УФ-света длиной волны 260 нм. Концентрация ДНК варьировала в пределах 18,9 нг/мкл - 213,2 нг/мкл при значении медианы 58,7 нг/мкл. Таким образом, все образцы содержат ДНК в количестве, превышающем минимально необходимое для проведения ПНР (около 10 нг/мкл) [5]. Переведение исходного материала в физиологический раствор позволило успешно экстрагировать ДНК из фиксированных лимфоцитов. Отсутствие в данном эксперименте препаратов ДНК, подлежащих выбраковке, показывает, что признак «замены этанол-уксусного фиксатора на физиологический раствор» является существенным, находится в причинно-следственной связи с техническим результатом и позволяет достичь предполагаемые количественные характеристики конечного продукта.

Степень очистки препаратов ДНК от примесей, прежде всего белковой природы, представлена на фиг. 2. При оценке данного показателя для каждого препарата рассчитывалось отношение степени поглощения УФ-света при 260 нм (максимум поглощения для двунитевой ДНК) к степени поглощения УФ-света при 280 нм (максимум поглощения для белков). Величина показателя 260/280 варьировала в пределах 1,47-2,53 при значении медианы 1,96. Большинство образцов характеризовались хорошей и отличной степенью очистки ДНК от белковых примесей (1,7-2,0) [5].

Следовательно, признак «замена этанол-уксусного фиксатора на физиологический раствор» является существенным и находится в причинно-следственной связи с техническим результатом и позволяет достичь ожидаемые качественные характеристики конечного продукта.

При этом определяющими отличительными признаками способа по сравнению с прототипом и подтверждающими преимущество заявленного изобретения являются:

1. Возможность использования для получения ДНК лимфоцитов человека, подвергшихся обработке этанол-уксусным фиксатором.

2. Концентрация ДНК в полученных образцах и уровень содержания в них примесей допускают дальнейшее проведение ПЦР.

3. Для осуществления способа используются готовые коммерческие реагенты и материалы, обеспечивающие простоту и надежность методики.

На фиг. 3 показана электрофореграмма продуктов ПЦР, проведенной с использованием ДНК, выделенной заявляемым способом, что поясняется в приведенном ниже примере, подтверждающем практическое применение заявленного способа.

Пример 1 (исследования проводились авторами изобретения в центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО КемГМА).

При установлении генетических причин мужского бесплодия у группы пациентов было необходимо провести ПЦР-анализ микроделеций в AZF-регионе Y-хромосомы. Единственным доступным источником ДНК являлись лимфоциты периферической крови, подготовленные для цитогенетического исследования и длительно хранящиеся в виде суспензии в этанол-уксусном фиксаторе при температуре +4°С.

Суспензию лимфоцитов в этанол-уксусном фиксаторе в объеме 10 мл центрифугировали в пробирках на 15 мл 10 минут при 1200 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли до объема 1 мл, а осадок ресуспендировали и переносили в микропробирки объемом 1,5 мл. Центрифугировали микропробирки 10 минут при 10000 об/мин. Полностью удаляли надосадочную жидкость, осадок подсушивали в течение 5 минут при 55°С. К подсушенному осадку лимфоцитов добавляли 100 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl), тщательно ресуспендировали.

К полученной суспензии добавляли 300 мкл коммерческого лизирующего реагента из набора «Универсальная пробоподготовка» («УП») производства ООО «Научно-производственная фирма «Генлаб», тщательно перемешивали и прогревали пробирку 5 минут при 65°С. Добавляли в пробирку 20 мкл суспензии сорбента из комплекта «УП». Пробирку встряхивали на вортексе, а затем центрифугировали 15 секунд при 5000 об/мин. Супернатант удаляли.

Осажденный сорбент промывали 1 мл спиртово-солевого буфера, центрифугировали пробирку 15 секунд при 5000 об/мин, супернатант удаляли. Повторяли промывку сорбента 1 мл спиртово-солевого буфера. Центрифугировали пробирку 15 секунд при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок подсушивали при 65°С 5 минут.

Переводили ДНК в водную фазу с помощью 100 мкл элюента из комплекта «УП» при 65°С в течение 5 минут, центрифугировали пробирку 1 минуту при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК, переносили в чистую пробирку и использовали для постановки ПЦР.

Проводили мультиплексную ПЦР для одновременной диагностики AZF-делеций в субрегионах AZFa, AZFb, AZFc Y-хромосомы. При этом использовали коммерческий набор «AZF-делеции» производства ООО «Научно-производственная фирма «Литех». В качестве мишеней для ПЦР используются STS-маркеры, локализованные в субрегионах AZFa (sY84 и sY86), AZFb (sY127 и sY134), AZFc (sY254 и sY255) (фиг. 3). Мишенями внутреннего контроля являются участки локусов ZFX/Y и SRY, расположенные в коротком плече хромосомы Y. Для каждого исследуемого образца одновременно выполняются 2 теста (система А и система В), что повышает надежность анализа.

В качестве положительного контрольного образца была использована ДНК фертильного мужчины, входящая в комплект реагентов (К+). Как видно, образцы ДНК всех пациентов (№1-6) характеризовались высокой эффективностью ПЦР по всем маркерам, не уступая по качеству положительному контрольному образцу. Это свидетельствует, с одной стороны, об отсутствии деградации ДНК в ходе самой процедуры выделения и о высокой ее концентрации в конечном растворе. Кроме того, в пробе отсутствуют ингибиторы ПЦР или их содержание не достаточно для существенного ухудшения качества ПЦР.

По результатам генотипирования удалось сделать заключение о присутствии всех изучаемых STS-маркеров у пациентов, что свидетельствует об отсутствии у них AZF-микроделеций. Поскольку в данном эксперименте была использована партия биологических образцов от нескольких человек, можно говорить о высокой воспроизводимости результата применения заявленного изобретения. Формула изобретения «замена этанол-уксусного фиксатора на физиологический раствор, при этом замена фиксатора осуществляется центрифугированием клеточной суспензии, удалением надосадочной жидкости, высушиванием полученного препарата в течение 5 мин при 55°С, добавлением физиологического раствора и ресуспендированием клеточной массы» позволяет получить препарат ДНК, соответствующий требованиям проведения ПЦР. Следовательно, заявленный технический результат достигается.

Используемая литература

1. Корниенко И.В. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК, ее качественная и количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения / И.В. Корниенко, С.Г. Харламов. - Ростов-на-Дону: изд-во Южного федерального университета, 2012. - 216 с.

2. Клаус Дж. Лимфоциты: Методы / Дж. Клаус. - М.: Мир, 1990. - 394 с.

3. Boom R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C.J.A. Sol, M.M.M. Salimans et al. // J. Clin. Microbiol. - 1990. - V. 28, №3. - Р. 495-503.

4. Способ получения нуклеиновых кислот: пат. №2272072 (заявка №2004126133, класс МПК C12N 15/10) / П.Л. Лактионов, С.М. Тамкович, Е.Ю. Рыкова и др.; опубл. 20.03.2006.

5. Rethmeyer J.A. Comparison of biological specimens and DNA collection methods for PCR amplification and microarray analysis / A.J. Rethmeyer, X. Tan, A. Manzardo et al. // Clin Chem Lab Med. - 2013. - 51(5): doi: 10.1515/cclm-2012-0429.