СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике и может быть использовано как вариант для определения антиоксидантного потенциала микроорганизмов при оценке антиоксидантного статуса и микроэкологических особенностей организма человека.

Описание изобретения

Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике и может быть использовано как вариант определения антиоксидантного потенциала микроорганизмов при оценке микробного статуса организма человека. Типовые патологические процессы, такие как гипоксия и воспаление, свойственные и развивающиеся при большинстве соматических и инфекционных заболеваниях, тяжелых травмах и ранениях, всегда сопровождаются избыточным образованием активных форм кислорода, что приводит к усилению процессов перекисного окисления липидов, входящих в состав клеточных мембран [1]. Существенный вклад в поддержании окислительно-восстановительного баланса организма вносит нормальная микрофлора [2].

Известен способ RU №2112241, C1 ⁶G01N 33/48, G01N 33/50 (дата публикации формулы изобретения 1998.05.27) определения концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК). В данном способе для анализа используют минимальное количество сыворотки крови или гомогената (0,2-0,5 мл), растворение ТБК и инкубацию образца проводят в присутствии Тритона Х-100, смесь перемешивают с постоянной частотой колебаний (120 качаний в мин), реакцию останавливают дигидрокверцетином; перед определением оптической плотности образца добавляют трилон Б и смесь этанола с хлороформом в соотношении (7:3). В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм. Рабочий раствор тиобарбитуровой кислоты (ТБК) готовят путем растворения навески ТБК 864 мг в 100 мл смеси, содержащей 1% раствор тритона Х-100 и 8,2 М раствор этанола.

Однако данный способ обладает рядом недостатков: он не учитывает специфики метаболизма микроорганизмов, для повышения растворимости липидных фракций и 2-тиобарбитуровой кислоты предлагается использовать специальный реактив (полиоксиэтилен-п-(трет-октил) фенол (Тритон Х-100)), а также реактив, требующий особых условий хранения и работы (трихлорметан). Наиболее близким к заявляемому является способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте Фентона RU 2279079, С2 G01N 33/483, C12Q 1/02.

В заявляемом способе выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте Фентона исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием, параллельно готовят контроль, представляющий жидкую питательную среду, далее каждую из проб обрабатывают хлороформом и отделяют супернатант от хлороформа центрифугированием, затем в опытную пробу и контроль добавляют тест-культуру Staphylococcus aureus ГИСК №201108, инкубируют, отделяют клетки тест-культуры центрифугированием и готовят из них микробную взвесь, в каждую из проб добавляют раствор пероксида водорода и инкубируют, отделяют клетки тест-культуры центрифугированием, добавляют к ним питательную среду, инкубируют, измеряют оптическую плотность выросших культур в опытной и контрольной пробах, определяют степень прироста биомассы тест-культуры в опыте. Недостатком данного способа является использование в качестве показателя протективного эффекта микроорганизмов только степень прироста клеточной массы по оптической плотности. Поэтому способ не учитывает кинетических показателей, возникающих при добавлении в исследуемую систему прооксидантов. Способ характеризует длительность и относительная многостадийность. Результаты эксперимента требуют нескольких стадий инкубации, которые должны подбираться с учетом физиологии микроорганизмов. Рассматриваемый способ не позволяет определять количественные характеристики, отражающие антиоксидантный потенциал микроорганизмов, входящих в состав микробиоценоза человека. Определение протективного действия у исследуемой культуры в эффекте Фентона, по этому способу, возможно только при наличии в среде малых концентраций пероксида водорода.

Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование известного способа определения антиоксидантной активности, а также возможность использования предлагаемого способа для определения антиоксидантного статуса у микроорганизмов, не продуцирующих пероксид водорода и/или инактивирующих его ферментов.

Сущностью способа является определение антиоксидантного статуса микроорганизмов по их способности блокировать реакцию перекисного окисления липидов и/или ингибировать фосфолипазы.

Способ определения антиоксидантной активности микроорганизмов заключается в том, что оценивается антиоксидантная активность бульонных культур микроорганизмов или взвеси микроорганизмов в физиологическом растворе, выращенных на плотной питательной среде. В предлагаемом способе в качестве окисляемой среды используется раствор лецитина. Известно, что под действием фосфолипаз от лецитина отщепляется одна из жирных кислот, превращая его в лизолецитин. Данный продукт обладает высокой токсичностью в отношении клеток, вызывая их некроз [1]. По предлагаемому способу перекисное окисление лецитина запускается добавлением к нему суспензии клеток микроорганизмов - продуцентов фосфолипаз, выделенных от обследуемого, а при их отсутствии используется известный музейный штамм с фосфолипазной активностью. Далее, в среду последовательно добавляются водный раствор аскорбиновой кислоты, ионы железа (II) (в виде раствора железа сульфата). После этого анализируемые образцы инкубируют в течение 30 мин при температуре 42°С, при постоянном встряхивании. После этого в исследуемый образец вносят концентрированную ортофосфорную кислоту до рН 1, и 1% раствор 2-тиобарбитуровой кислоты в диметилсульфоксиде и этаноле (1:1). Реакционную смесь нагревают в водяной бане при t=70°C в течение 20 мин, охлаждают в темном месте до температуры +4°С и добавляют 3 мл н-бутанола, тщательно перемешивают, центрифугируют при 3 тыс. об/мин, отделяют бутанольную фазу и спектрофотометрируют, учитывая минимум пропускания при 550 нм. При спектрофотометрировании кюветой сравнения является кювета с н-бутанолом. В заявляемом способе используется несколько контролей: контроль максимально-возможной перекисной реакции (для осуществляемого исследования), для этого используют образец лецитина с инициированным окислением без антиоксиданта и контроль ингибирования перекисного окисления, где в качестве образцов сравнения используют эквимолярные количества вещества с известной антиоксидантной активностью. Для сравнения антиоксидантного статуса веществ в гидрофильной фазе использован водный раствор 6-метил-2-этил-пиридин-3-ола, а у веществ с липофильными свойствами в качестве образца сравнения используется токоферола ацетата - масляный раствор.

Количественно антиоксидантную активность выражают в условных единицах антиоксидантной активности (Е_аоа), рассчитанных по формуле

где

Е_аоа - единицы антиоксидантной активности,

I_A - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора исследуемого образца при 550 нм,

I_B - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора питательной среды при 550 нм,

I_C - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора контроля с индуцированным окислением при 550 нм,

10 - коэффициент перевода в единицы объема,

I_E - молярный коэффициент триметинового комплекса в единицах пропускания 0,413 ммоль·см^-1,

I_D - интенсивность светового потока (в единицах пропускания), прошедшего через слой поглощающего раствора контроля с известным антиоксидантом при 550 нм.

Пример 1.

Культуру Staphylococcus aureus, выделенную из кишечного микробиоценоза обследуемого, выращивали на мясо-пептонном агаре при 37°С в течение 48 ч. Затем суспендировали в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида и стандартизировали по стандарту мутности до 10⁹ микробных тел в 1 мл.

Выделенный из каловых масс этого же пациента штамм Bifidobacterium breve, выращивали в жидкой питательной среде Блаурокка. В день исследований готовили растворы: лецитина 0,1%, аскорбиновой кислоты 0,79М, сульфата железа 0,07М на бидистиллированной, свежепрокипяченой и охлажденной до комнатной температуры воде.

В опытные пробирки добавляли по 0,5 мл раствора лецитина, 0,3 мл бактериального субстрата, исследуемого на антиоксидантную активность - В.breve, и 0,8 мл раствора аскорбиновой кислоты. Реакцию образования свободных радикалов инициировали добавлением 0,8 мл раствора железа сульфата. Пробирки помещали в термостат при постоянном встряхивании на 30 мин. В качестве контроля эталонного антиоксиданта использовали 0,3 мл раствора эмоксипина. В качестве контроля максимально возможного перекисного окисления использовали пробирку с образцом лецитина, где инициирован процесс в отсутствии антиоксиданта. Исследуемые пробирки помещали в термостат на 30 мин, при температуре 42°С, при постоянном встряхивании. После этого в исследуемые образцы последовательно вносили 0,2 мл концентрированной ортофосфорной кислоты и 0,8 мл 1% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Полученную реакционную смесь нагревали в водяной бане при t=70°C в течение 20 мин, охлаждали в темном месте до температуры +4°С и при тщательном перемешивании добавляли 3 мл н-бутанола. Полученную эмульсию центрифугировали при 3 тыс. об/мин, аккуратно отделяли бутанольную фазу, которую спектрофотометрировали на спектрофотометре СФ-2000, учитывая единицы пропускания при 550 нм. В качестве кюветы сравнения использовали кювету с н-бутанолом. Подставив полученные значения в формулу, рассчитали, что для анализируемого штамма Bifidobacterium breve антиоксидантная активность составила 3,03 Е_аоа.

Источники информации

1. Шанин В.Ю. Клиническая патофизиология. С-Пб.: «Специальная литература», 1998, 569 с.

2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание, в 3-х т. / Б.А.Шендеров. - М.: Грань, 2001, т.3, 288 с.