Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения интенсивности воспалительного процесса мышечной ткани с использованием инфракрасной спектроскопии

Изобретение относится к медицине, преимущественно к хирургии и патологической физиологии, и может быть использовано для определения степени воспалительного процесса такни. Предложен способ, при котором определяется степень воспалительного процесса биоптата мышечной ткани с помощью метода инфракрасной спектроскопии, путем регистрации высоты пиков полос поглощения с максимумами 1550, 1516, 1402, 1307 и 1048 см^-1. ± 4 см^-1.

Воспалительные явления тканей брюшины могут представлять угрожающую опасность, в некоторых случаях, требуют применения неотлагательных способов коррекции (введение антиоксидантов, антигипоксантов, нестероидных или стероидных противовоспалительных средств, антиагрегантов, антикоагулянтов, антибактериальных препаратов и др.). Для назначения оптимальных средств коррекции необходимо знать выраженность степени воспалительного процесса. С другой стороны, высокая степень воспалительного процесса делает невозможным использование корректирующих хирургических вмешательств с применением и постановкой стентов, сетчатых имплантов и др. Эти особенности являются актуальными как для экспериментальной, так и практической хирургии. Одним из известных подходов является гистологическое исследование биоптата. Однако, данный способ требует многочасового, а по некоторым методикам - многосуточной подготовки биоптата к микроскопическому анализу. Так, при подготовке образов для микроскопии (гистологического исследования) используется многочасовая обработка ткани органическими растворителями различной концентрации, последующая визуализация структур соответствующим красителем, с дальнейшим фиксированием биоптата, например, в парафине или целлуидине и нарезка образца на микротоме. Все это увеличивает трудоемкость процесса и продолжительность анализа.

Наиболее близким к заявляемому, является способ дифференциальной диагностики деструктивного панкреатита патент RU №2253868. Для диагностики данной патологии, у больного забирают кровь из вены, отделяют сыворотку, из которой путем высушивания и суспензирования с вазелиновым маслом готовят образец. Образец подвергают инфракрасной спектроскопии на спектрофотометре с регистрацией спектров поглощения в области 1200-1000 см^-1.

Регистрируют высоты пиков полос поглощения с максимумами при 1170; 1165; 1125; 1105; 1100; 1070; 1060; 1050; 1025 см^-1. При значениях показателей 1170 < 2,0; 1165 < 4,6; 1125 < 3,5 диагностируют отечную форму острого панкреатита, а при значениях показателей 1105 > 1,9; 1100 > 2,2; 1070 > 4,3; 1060 > 4,0; 1050 > 4,7; 1025 > 4,6 - деструктивную форму. Однако, данный способ обладает рядом недостатков. По известному способу, определяются реактивные изменения только паренхиматозного органа - поджелудочной железы. Способ позволяет определять параметры только по характеристике выделенной фракции венозной крови, по этой причине способ не обладает селективностью к определенным участкам организма или органа. Существует зависимость между количеством образца и интенсивностью сигнала.

С другой стороны в практике экспериментальной или практической абдоминальной хирургии, важно иметь надежный лабораторный способ быстрого определения выраженности степени воспалительного процесса и его возможной локализации.

В предлагаемом способе используется спектральное исследование биоптата в инфракрасной области спектра (ИК) после предварительной пробоподготовки.

Техническим результатом является разработка точного, информативного, воспроизводимого способа диагностики выраженности воспалительного процесса, с возможностью определения его локализации. Существенным достоинством предлагаемого способа является значительное снижение время и трудозатрат.

Предлагается способ определения степени воспалительного процесса ткани методом спектроскопии в инфракрасной области, включающий исследование биологического материала, образца мышечной ткани.

Отличием является то, что биологический материал готовят путем последовательной трехкратной обработки изотоническим раствором натрия хлорида, двукратной обработки абсолютизированным изопропиловым спиртом с последующим воздействием на образец ультразвуком с частотой 25 кГц в течении 30 мин, с последующим выполнением инфракрасной спектроскопии в диапазоне 4000-900 см^-1 в режиме многократно нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) на цинк-селенидном кристалле и определением интенсивности полос поглощения с максимумами при 1550, 1516, 1402 см^-1 1307 и 1048 см^-1. ± 4 см^-1.

Сущность метода заключается в следующем. Образец мышечной ткани, забранный в момент оперативного вмешательства, в дальнейшем используемый как стандарт, отмывается трехкратными объемами изотонического раствора хлорида натрия 0,9%. После этого, избыток влаги удаляется салфеткой, а образец двукратно промывается абсолютизированным изопропиловым спиртом. Отмытый образец помещается в полиэтиленовую камеру, содержащую абсолютизированный изопропиловый спирт. Закрытая камера с образцом помещается в ультразвуковую ванну, где подвергается обработке при 25 кГц в течении 30 мин. Обработанный ультразвуком образец, освобожденный от избытка изопропилового спирта, помещается в кювету спектрометра.

На фиг 1. Показано ИК - спектры образцов биоптатов мышечной ткани в диапазоне 4000-1000 см^-1, где 1 - первый день; 3 - третий день; 7 - седьмой день. Максимумы поглощения у образца с выраженной воспалительной стадией (третий день): 1635, 1551, 1402 см^-1.

В результате проведенных предварительных исследований показано, что наиболее оптимальным является применение режима многократно нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО). У полученного ИК-спектра образца оценивается интенсивность полос с максимумами 1550, 1516, 1402 см^-1 1307 и 1048 см^-1. ± 4 см^-1. Степень воспалительного процесса ткани прямо пропорциональна интенсивности поглощения. Таким образом, у образцов, полученных в момент острой фазы воспалительного процесса, обнаруживается относительное увеличение поглощения при 1635, 1551, 1402 см^-1. При стихании и регрессе воспаления, на спектрах обнаруживается уменьшение поглощения с тенденцией к исходному уровню (стандарта). Способ позволяет анализировать динамические показатели изменения выраженности воспалительного процесса, а так же определять интенсивность воспаления различных участков. Проведение анализа от момента предоставления материала, до получения результата занимает 40-50 минут. Этот временной показатель значительно ниже, чем времязатраты в классических гистоморфологических исследованиях. Кроме того, способ может быть использован для проведения мониторинга за эффективностью лечения.

Пример 1.

Предоставленные на анализ биоптаты получены после информированного согласия пациента К. при проведении срединной лапаротомии по поводу острого разлитого перитонита.

Исследование ИК спектров биоптатов выполнено на приборе ФСМ-1202 Инфраспек (Россия) с использованием приставки МНПВО горизонтального типа (Модель МНПВО 36) (серия 100096). Параметры записи спектров: диапазон длин волн 4000-900 см^-1, разрешение 4 см^-1, циклическая запись с количеством сканов 75. Фоновый спектр получали непосредственно перед записью каждого спектра. Управление прибором и обработку спектров осуществляли с использованием программы Fspec (версия 4.0.0.2).

Пробоподготовка образцов заключалась в отмыве биоптата мышечной ткани изотоническим раствором хлорида натрия (0,9%), двукратной обработке абсолютизированным изопропиловым спиртом, УЗ обработке при 25 кГц в течении 30 мин, с последующей нарезкой подготовленного образца с использованием вибротома.

Полученные спектральные характеристики образцов, включали оценку значения реперных полос поглощения: 1550, 1516, 1307 и 1048 см^-1.

Образец первых суток характеризуют полосы поглощения 1550, 1516, 1307 и 1048 см^-1, что соответствует фрагментам аминогрупп и амидным связям, сложноэфирным связям пептидных образований и родственных структур (фиг. 1) [1, 2, 3].

На третьи сутки характерно усиление полос поглощения 1550, 1401 см^-1 1049 см^-1, что на прямую связано с изменениями пептидных структур и в целом, белковых образований [2].

Образец седьмых суток характеризует наличие полосы поглощения 1515 см^-1, что связано с образованием соединительно-тканных структур (коллагеновых волокон) [1,2].

Полученные результаты были подтверждены гистологическим исследованием мышечной ткани. В результате проведенного анализа установлено:

1-е сутки: Отек и разрыхление межмышечной соединительной ткани и эндомизия. Сосуды расширены и полнокровны. Местами определяются обширные, кровоизлияния. Отдельные мышечные волокна теряют поперечную исчерченность. Выявляются очаги набухания и разволокнения мышечных волокон. Отмечается их фрагментация.

3-й сутки: В окружающей мышечной клетчатке диффузное гнойное воспаление: обильная лейкоцитарная инфильтрация, группы склеивающихся и распадающихся лейкоцитов, микробные тельца, резкое полнокровие сосудов, кровоизлияния. В прилежащих мышцах - флегмонозное воспаление с гнойным расплавлением мышечных волокон. В толще мышц - картина осторого миозита: лейкоцитарная инфильтрация соединительнотканных прослоек, полнокровие сосудов, потеря волокнами поперечной исчерченности, очаги миолиза.

7-е сутки: В окружающих тканях наряду с сохраняющимся некрозом и диффузной лейкоцитарной инфильтрацией обнаруживается грануляционная ткань, представленная большим количеством сосудов капиллярного типа и клеточными элементами: фибробластами, макрофагами, лейкоцитами, плазматическими клетками и нейтрофильными лейкоцитами. Волокнистые структуры представлены отдельными тонкими нежными волокнами. В мышцах утолщаются, «огрубевают» соединительнотканные прослойки за счет увеличения коллагеновых волокон. На месте разрушенных мышечных волокон появляется молодая соединительная ткань, состоящая из нежных тонких коллагеновых волокон и клеточных элементов: фибробластов, макрофагов, лимфоцитов, плазматических клеток, единичных нейтрофильных лейкоцитов.

Список литературы

1. Купцов А.Х. Фурье-спктры комбинационного рассеяния и инфракрасного поглощения полимеров / А.Х. Купцов, Г.Н. Жижин. - М.: Физматлит, 2001. - 656 с.

2. Элиот А. Инфракрасные спектры и структура полимеров / А. Элиот -- М.: Мир, 1972. - 159 с.

3. Silverstein, R.М, Webster F.X., Kiemle D.J. Spectrometric identification of organic compounds. - Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, - 2005. - 551p.