НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ГЕНА msp4 РИККЕТСИИ Anaplasma marginale МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ "РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ"

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, ветеринарной медицины, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции видоспецифичного фрагмента ДНК Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени», содержащему два олигодезоксирибонуклеотидных праймера (прямой и обратный) и один флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Anaplasma marginale (Род Anaplasma, отряд Rickettsiales, семейство Anaplasmatacea) является возбудителем анаплазмоза крупного рогатого скота (далее - КРС). A. marginale - облигатный внутриклеточный паразит, поражающий эритроциты. Анаплазмоз, вызванный A. marginale, протекает с признаками лихорадки, анемии, атонии желудочно-кишечного тракта и истощения. Смертность больных животных по разным оценкам составляет от 30 до 100%. Источником возбудителя являются инфицированные животные, переносчиками - около 20 видов клещей, а также кровососущие насекомые (Kocan, К.М., delaFuente, J., Blouin, E.F., Garcia-Garcia, J.C., 2004. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances indefining host-pathogen adaptation sofa tick-borne rickettsia. Parasitology 129, S285-S300. СайтИнтернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15938516, 2015 г.; Scoles, G.A., Broce, A.B., Lysyk, T.J., Palmer, G.H., 2005. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). J. Med. Entomol. 42, 668-675. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16119558, 2015 г.). Возможна также механическая передача возбудителя от зараженных животных к здоровым через нестерильные инструменты при проведении зоотехнических мероприятий.

Анаплазмоз крупного рогатого скота широко распространен во всем мире и приводит к значительным экономическим потерям вследствие уменьшения мясомолочной продуктивности скота, ущерба от недополучения молодняка и гибели животных. Анаплазмоз КРС, вызванный A. marginale, зарегистрирован во многих тропических и субстропических странах. Анаплазмоз КРС является эндемичным для Мексики, Центральной и Южной Америки, Карибских островов, Африки и Азии. Энзоотическими очагами анаплазмоза являются все страны Латинской Америки (Guglielmone, А.А., 1995. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and Central America. Vet. Parasitol. 57, 109-119. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7597777, 2015 г.). Анаплазмоз КРС распространен фактически по всей территории США и Канады, также в некоторых странах Европы, главным образом средиземноморских (DelaFuente, J., Lew, A., Lutz, Н., Meli, M.L., Hofmann-Lehmann, R., Shkap, V., etal., 2005. Genetic diversity of Anaplasma species major surface proteins and implications for anaplasmosis serodiagnosis and vaccine development. Anim. Health Res. Rev. 6, 75-89. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16164010, 2015 г.). Это заболевание регистрируют в Украине, Белоруссии, Молдавии, Казахстане, государствах Средней Азии и Закавказья. Согласно ветеринарной отчетности в Российской Федерации неблагополучными по анаплазмозу являются субъекты Центрального, Северо-Западного и Приволжского федеральных округов (Гулюкин М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) / М.И. Гулюкин, В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко // РВЖ.СХЖ. - 2013. - №2. - С. 36-40. Сайт Интернет: http://cyberleninka.ru/article/n/monitoring-epizooticheskoy-situatsii-po-protozoynym-kroveparazitarnym-boleznyam-domashnih-zhivotnyh-v-rossiyskoy-federatsii-2007-2012, 2015 г.).

Своевременная диагностика играет решающую роль в предотвращении распространения инфекционных заболеваний. Многообразие клинических проявлений анаплазмоза затрудняет его диагностику, поэтому проблема создания надежных тест-систем для выявления патогенных видов анаплазм остается актуальной. На сегодняшний день для диагностики анаплазмоза применяют в основном микроскопические и серологические методы исследования, однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, а именно недостаточно высокую чувствительность и специфичность. Так, результаты микроскопических исследований мазков крови ненадежны на ранних стадиях инфицирования и в случаях заболеваний, сопровождающихся тяжелой формой анемии, а серологические методы, основанные на использовании антител к антигенам A. marginale, имеют недостаточно высокую чувствительность и не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм (Dreher, U. М., J. Fuente, R. Hofmann-Lehmann, М. L. Meli, N. Pusterla, К. М. Kocan, Z. Woldehiwet, U. Braun, G. Regula, К. D. Staerk, and H. Lutz, 2005: Serologic crossreactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12, 1177-1183. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16210480, 2015 г.).

Наиболее оперативную и точную диагностическую информацию позволяет получить выявление ДНК возбудителей анаплазмоза в крови КРС с помощью полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР). Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) специфического фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров до количеств, достаточных для его детекции любым из известных методов - электрофоретическим, гибридизационно-ферментным или гибридизационно-флуоресцентным. Преимуществом ПЦР-диагностики является высокая чувствительность и специфичность - она позволяет обнаружить возбудителя на самых ранних стадиях заболевания, в том числе и во время латентной фазы, и надежно дифференцировать анаплазмоз от ряда сходных по клиническим проявлениям заболеваний. Другими достоинствами метода являются небольшие затраты времени на проведение анализа и возможность автоматизации процесса.

ПЦР является единственным средством для диагностики анаплазмоза при носительстве в отсутствии клинических симптомов (Kocan KM, de la Fuente J, Blouin EF, Coetzee JF, Ewing SA. The natural history of Anaplasma marginale. Vet Parasitol. 2010 Feb 10; 167(2-4): 95-107. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19811876, 2015 г.).

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (OIE, the World Organisation for Animal Health), изложенным в «Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных 2015 г.» (Сайт Интернет: http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/, 2015 г.), ПЦР-диагностику A. marginale следует применять перед каждым перемещением животного на новое место и для подтверждения диагноза.

На сегодняшний день описаны разные методы ПЦР для детекции A. marginale, однако ни один из них не лишен недостатков, которые связаны с выбором мишени для ПЦР и способа получения и анализа результатов. Сложность выбора олигодезоксирибонуклеотидов для ПЦР состоит в том, что они должны обладать строгой видовой специфичностью. В случае использования в полимеразной цепной реакции праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, не имеющих видовой специфичности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае же, если выбранные олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд имеют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить амплификацию и детекцию методом ПЦР в режиме «реального времени» строго целевого фрагмента ДНК.

Известен набор праймеров для амплификации фрагмента гена msp4 A. marginale: MSP45: 5′-GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3′ и MSP43: 5′-CCGGATCCTTAGCTGAACAGGAATCTTGC-3′ (De la Fuente J, Van Den Bussche RA, Kocan KM. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae). Vet Parasitol. 2001 97, 65-76. Сайт Интернет:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11337128, 2015 г.). Недостатком этого метода является отсутствие видоспецифичности у праймеров - они имеют 100%-ную идентичность с соответствующими участками гена msp4 другого вида анаплазмы - A. ovis, и поэтому не могут быть использованы для дифференцирования этих двух патогенов.

Известен набор из праймеров на ген msp4: AmarMSP4.520f 5′-TGACGTGCTGCACACAGATTT-3′ и AmarMSP4.586r 5′-AACAAAGCTTGCGCCTATCC-3′ и ДНК-зонда 5′-6FAM-CCTGTGTCCCCGTATGTATGTGCCG-3′ (Fyumagwa RD, Simmler P, Meli ML, Hoare R, Hofmann-Lehmann R, Lutz H. Prevalence of Anaplasma marginale in different tick species from Ngorongoro Crater, Tanzania. Vet Parasitol. 2009 Apr 6; 161(l-2): 154-7. doi: 10.1016/j.vetpar.2008.12.018. Epub 2009 Jan 14. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19201099, 2015 г.). Недостатком данного метода является высокая степень идентичности (90-95%) последовательностей праймеров и зонда с соответствующими участками гена msp4 двух других близкородственных видов анаплазм - A. ovis и A. centrale, что уменьшает надежность правильной идентификации патогена.

Ближайшим аналогом является набор из двух праймеров на ген msp4 AmargMSP4Fw: 5-CTGAAGGGGGAGTAATGGG-3 и AmargMSP4Rev: 5-GGTAATAGCTGCCAGAGATTCC-3 (прототип - Torina A, Agnone A, Blanda V, Alongi A, D′Agostino R, Caracappa S, Marino AM, Di Marco V, de la Fuente J. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale. Ticks Tick Borne Dis. 2012 Dec; 3(5-6): 283-7. Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23182548, 2015 г.), который позволяет дифференциально выявлять A. marginale. Недостатком метода является необходимость анализировать результаты ПЦР методом электрофореза, что увеличивает время проведения анализа.

Задачей изобретения является создание набора синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A. marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени», который может быть использован для дифференциального выявления риккетсий A. marginale в крови крупного рогатого скота и других жвачных животных, а также в кровососущих членистоногих.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении надежности детекции A. marginale, упрощении анализа и сокращении времени его проведения до 1.5 часов (не включая подготовку пробы), а также уменьшении стоимости анализа.

Технический результат достигается тем, что набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для детекции гена msp4 риккетсии Anaplasma marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» содержит два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, которые имеют следующую структуру:

Прямой праймер: F: 5-CATGAGTCACGAAGTGGCT-3′

Обратный праймер: R: 5′-GGCACACTCACATCAATC-3′

Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд:

Probe: 5′-Cy5-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-BHQ2.

Преимуществом использования в ПЦР флуоресцентно-меченого ДНК-зонда Probe: 5′-Cy5-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-BHQ2 является отсутствие необходимости проведения дополнительной стадии анализа - электрофоретической детекции результатов ПЦР, поскольку регистрация накопления ДНК происходит непосредственно в ходе самой реакции, что приводит к значительному сокращению времени исследования (до 1.5 часов, не включая подготовку пробы), а использование флуоресцентно-меченого зонда повышает надежность исследования.

В рамках патентуемого технического решения разработанные олигодезоксирибонуклеотиды к гену msp4 являются видоспецифичными для A. marginale и позволяют достоверно выявлять методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» наличие гена msp4 и, следовательно, риккетсии A. marginale в крови крупного рогатого скота и других жвачных животных, а также у кровососущих членистоногих.

Характеристика набора олигодезоксирибонуклеотидов и участка амплифицируемой ДНК

Предлагаемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры фланкируют участок гена msp4 A. marginale длиной 177 пар нуклеотидов. Использование в наборе с патентуемыми олигодезоксирибонуклеотидными праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продукта амплификации в режиме «реального времени».

Перечень графических материалов

На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена msp4 A. marginale и отмечены участки гена, к которым подобраны патентуемые олигодезоксирибонуклеотиды.

На фиг. 2 представлен результат электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР с использованием патентуемых олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и ДНК, выделенной из крови неинфицированной (К-) и инфицированных (1-6) коров; маркер длин ДНК 100-1000 п. н.

На фиг. 3 представлены графики накопления продукта ПЦР в режиме «реального времени» с использованием патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов и ДНК, выделенной из крови неинфицированной (К-) и инфицированных коров (1-6). По оси абсцисс отображено количество циклов ПЦР, по оси ординат - интенсивность флуоресценции (F).

Методика конструирования набора олигодезоксирибонуклеотидов

Выбор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A. marginale методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» осуществляли на основе последовательностей полноразмерного гена msp4 разных изолятов A. marginale. Ген msp4 кодирует иммунодоминантный белок наружной мембраны A. marginale. Для подбора праймеров были использованы имеющиеся в базе данных Генбанк (Сайт Интернет: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, 2015 г.) последовательности гена msp4 разных изолятов A. marginale, а также близкородственных видов анаплазм - A. centrale, A. ovis и A. phagocytophilum. Выявление характерных для A. marginale консервативных участков гена msp4 для подбора праймеров проводили с помощью сервера ClustalW2 (Сайт Интернет: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, 2015 г.). Видоспецифичность праймеров была проверена с использованием алгоритма BLASTN (Сайт Интернет: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 2015 г.). Выбор олигодезоксирибонуклеотидов основывался на следующих критериях: длина 18-25 пар нуклеотидов; температура отжига олигодезоксирибонуклеотидных праймеров сходная и находится в диапазоне 55-65°C; температура отжига ДНК-зонда выше температур отжига олигодезоксирибонуклеотидных праймеров; отсутствие в последовательности олигодезоксирибонуклеотида вторичных структур с температурой плавления выше его температуры отжига; отсутствие само- и взаимокомплементарности между 3′-концами выбранных олигонуклеотидов; отсутствие идентичности с участками геномов других видов анаплазм. В результате сравнительного анализа структуры гена msp4 разных изолятов A. marginale и близкородственных видов были разработаны и синтезированы олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд для проведения полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (табл. 1, фиг. 1), которые позволяют проводить дифференциальное выявление A. marginale.

Экстракция ДНК

Экстракцию ДНК из цельной крови коров проводили с использованием набора реагентов с помощью набора Sorb-M (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Проведение полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Реакцию амплификации проводили в 10 мкл смеси для ПЦР, содержащей 1×буфер для амплификации, 3 мМ MgCl₂, 0.2 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1 активную единицу HS Taq ДНК-полимеразы (все реактивы производства ЗАО «Евроген», Россия) ,2 мкл ДНК, 0.2 мкМ прямого и 0.2 мкМ обратного олигодезоксирибонуклеотидного праймера, 0.1 мкМ флуоресцентно-меченого ДНК-зонда.

Отработка условий амплификации проводилась при использовании ДНК коров, инфицированных A. marginale. Амплификация проводилась по следующей схеме: денатурация при 95°C - 3 мин (1 цикл); затем 45 циклов: денатурация при 95°C -15 с, отжиг при 58°C - 15 с, синтез при 72°C - 15 с; синтез при 72°C - 2 мин (1 цикл). Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу красителя Су5 на приборе «LightCycler 98» (Roche, Швейцария). Результаты ПЦР оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле по наличию продукта реакции длиной 177 пар нуклеотидов (фиг. 2) и по экспоненциальному росту флюоресценции (фиг. 3).

Апробация патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов

Апробацию патентуемых олигодезоксирибонуклеотидов проводили на образцах ДНК, выделенной из цельной крови коров, неинфицированных и инфицированных A. marginale. Экспериментально было показано, что выбранные олигодезоксирибонуклеотиды обеспечивают синтез и детекцию целевого фрагмента гена msp4 A. marginale длиной 177 пар нуклеотидов (фиг. 2, 3). Для подтверждения амплификации фрагмента целевого гена полученный фрагмент ДНК был лигирован в вектор pGEM-T Easy (Promega, США) и клонирован в клетках Escherichia coli DH5α. Выделенные плазмиды были секвенированы по методу Сэнгера. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLAST (Сайт Интернет: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, 2015 г.) показал, что они имеют 99-100% идентичности с фрагментом гена msp4 разных изолятов A. marginale.

Для испытания аналитической специфичности праймеров и зонда использовались образцы ДНК овец, зараженных близкородственным видом риккетсий - A. ovis, а также образцы ДНК коров, содержащие ДНК бактерий, не относящихся к роду Anaplasma - Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia. Анализ результатов ПЦР в режиме «реального времени» показал отсутствие роста флуоресценции, характерного для A. marginale, и отсутствие каких-либо продуктов ПЦР при анализе результатов методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Это свидетельствует об аналитической специфичности ПЦР с патентуемыми олиго дезоксирибонуклеотидами.

Таким образом, заявляемый набор синтетических олигодезоксирибонуклеотидов обеспечивает амплификацию и детекцию фрагмента гена msp4 риккетсии A. marginale методом ПЦР в режиме «реального времени».