СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ TRICHOPHYTON VERRUCOSUM В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМАХ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, лабораторной микологии и дерматовенерологии, и может быть использовано для диагностики зооантропонозной трихофитии.

В настоящее время сохраняется интерес к дерматофитиям, обусловленным зоофильными грибами. Периодические эпидемиологические вспышки этих инфекций регистрируются в различных областях нашей страны и за рубежом. В России наиболее неблагоприятными районами по заболеваемости трихофитией являются Северо-Кавказский и Уральский регионы, где заболеваемость в среднем составляет 7,8 и 6,9 на 100 тысяч населения соответственно. В Республике Башкортостан заболеваемость зооантропонозной трихофитией превышает заболеваемость в РФ в 5-6 раз [Латыпов, А.Б. Научное обоснование профилактики зооантропонозной трихофитии и совершенствования медицинской помощи больным (на примере Республики Башкортостан): дис... канд. мед. наук - Екатеринбург, 2007]. Одним из диагностических критериев постановки диагноза трихофитии являются клинические проявления. Однако клиническое многообразие, наличие атипичных и стертых клинических форм дерматофитий в настоящее время затрудняют своевременную диагностику [Блинов Н.П., Васильева Н.В., Разнатовский К.И. Дерматомикозы, или поверхностные микозы кожи и ее придатков, волос и ногтей. Лабораторная диагностика. Проблемы медицинской микологии 2008; 1:27-34]. Поэтому выставить окончательный диагноз микоза или снять его возможно только при проведении лабораторного обследования.

При подозрении на трихофитию основным методом лабораторной диагностики, как и при других дерматофитиях, является обнаружение возбудителя в исследуемом материале (частички кожи и волосы). Для этого в настоящее время применяются следующие методики [Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3. / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Лабора, 2009. - 880 с.]:

1. Микроскопия клинического материала - метод предварительной диагностики заболевания. В случаях отсутствия роста возбудителя в культуре положительный результат прямой микроскопии является единственным подтверждением микотической инфекции. Патологический материал изучают в нативных препаратах. Для просветления препаратов, т.е. для растворения роговых масс, используют 20% раствор едкой щелочи (КОН или NaOH).

2. Культуральный метод исследования до сих пор остается предпочтительным методом диагностики микозов. Осуществляется для окончательного уточнения диагноза и выяснения эпидемиологии. Она включает получение культуры гриба с последующим микроскопическим исследованием. По внешнему виду колоний на чашках Петри можно составить представление о роде возбудителя (Trichophyton), его виде (Trichophyton verrucosum). Окончательное уточнение рода и вида гриба возможно только на основании микроскопического исследования полученной культуры.

Однако все используемые методы имеют ряд существенных недостатков:

1. Микроскопия клинического материала не позволяет идентифицировать грибы в патологическом материале до вида по их морфологии. Кроме того чувствительность этого метода недостаточна.

2. Культуральный метод исследования является очень трудоемким и занимает от 5 до 21 дня. Несмотря на то что специфичность этого метода значительно выше, чем при микроскопии клинического материала, чувствительность этого метода тоже не достаточна.

Эффективность перечисленных методов лабораторной диагностики не в полной мере отражает истинную ситуацию по заболеваемости трихофитией. Следовательно, для формирования наиболее объективных представлений о масштабах ее распространения, необходимо широкое внедрение в практику здравоохранения и ветеринарной служб молекулярно-генетических методов диагностики, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую отличает исключительно высокая чувствительность и специфичность, что позволит выявлять Trichophyton verrucosum в клиническом материале при различных формах заболевания и, в особенности - при стертых и атипичных формах.

Известен способ диагностики дерматомикозов, заключающийся в том, что диагностику дерматомикозов осуществляют путем высева дерматофитов из клинического материала на плотную селективную среду Сабуро с добавлением антибиотика - левомицетина и гидролизата кератина, полученного из куриного пера. Питательная среда для выделения дерматофитов имеет следующий состав, г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар - 18,0-20,0; гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) - 10,0-20,0; левомицетин - 50000 ЕД; дистиллированная вода - остальное. Посев инкубируют при температуре 22-24°С в течение 4-8 дней с последующей идентификацией вида колоний. Способ наиболее эффективен при выделении из материала от больных культур грибов-дерматофитов, в частности Microsporum canis, Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes var. gypseum, Trichophyton rubrum [патент RU №2275631, 2006 г.].

Прототипом предлагаемого изобретения является способ диагностики онихомикоза кистей и стоп, сущность которого заключается в том, что грибок Trichophyton rubrum идентифицируют методом ПЦР, для чего выделяют ДНК из образца кожи или ногтевых пластинок, при этом для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 ч при температуре 50-65°С, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°С и высушивают при температуре 50-65°С; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов, имеющих последовательность: TR-1-F (смысловой): 5′ atcgaatctttgaacgcaca 3′; TR-1-R (антисмысловой): 5′ tataaagattggggccaggg 3′ и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum [патент RU №2319962, 2008 г.].

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного и высокочувствительного способа детекции Trichophyton verrucosum при различных клинических формах заболевания и,1 в особенности, при стертых и атипичных формах.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности лабораторной диагностики трихофитии у человека за счет достоверного обнаружения мицелия и спор Trichophyton verrucosum в клиническом материале.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе детекции Trichophyton verrucosum, включающем выделение тотальной нативной ДНК из клинического материала, представляющего образец кожи, проведение полимеразной цепной реакции, согласно изобретению в качестве клинического материала дополнительно используют волосы, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton verrucosum с использованием праймеров следующей структуры:

5′ CCACGATAGGGATCAGCGTT 3′;

5′ GAAAGTTTTAACTGATTTTGCTTG 3′ и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 231 п.н. определяют наличие возбудителя.

Предлагаемый способ детекции Trichophyton verrucosum осуществляется следующим образом. Из клинического материала (частички кожи и волосы) выделяют тотальную нативную ДНК, после чего проводят специфическую амплификацию (ПЦР) фрагмента гена 5.8S рибосомальной РНК (pPHK) Trichophyton verrucosum с использованием праймеров следующей структуры:

5′ CCACGATAGGGATCAGCGTT 3′,

5′ GAAAGTTTTAACTGATTTTGCTTG 3′.

При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 231 п.н. констатируют факт присутствия возбудителя в клиническом материале и подтверждают соответствующий диагноз.

ДНК выделяют из клинического материала (частички кожи и волосы). Для обеспечения необходимой степени чистоты ДНК и достаточного ее количества используют методику Boom R. [Boom R., et al. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol. 28: 495-503]:

1. В пробирку с 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидинтиоционат, 1% Triton X100) вносится 1 грамм исследуемого материала. Проба тщательно перемешивается на вортексе и прогревается 5 мин при температуре 65°С. Центрифугировали 5 сек при 5 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Когда проба растворялась не полностью, - пробирку центрифугировали на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочная жидкость переносится в новую чистую пробирку.

2. Отдельным наконечником в пробирку вносят 25 мкл ресуспендированного сорбента (силикагель, SiO₂). Перемешивают на вортексе, ставят в штатив на 2 мин, еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин.

3. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется с использованием вакуумного отсасывателя.

4. Далее в пробирку с сорбентом вносится 300 мкл раствора для отмывки (5М гуанидинтиоционат). Образовавшуюся смесь тщательно ресуспендируют на вортексе.

5. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс. об/мин на микроцентрифуге в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется с помощью вакуумного отсасывателя и чистого наконечника.

6. Добавляется 950 мкл отмывочного раствора (70% этиловый спирт). Сорбент ресуспендируют на вортексе, центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель и чистый наконечник.

7. Пробирку инкубируют при температуре 65°С 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышка пробирки должна быть открыта. В пробирку после подсушки добавляется 50 мкл ТЕ-буфера (1 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН 8.0) для элюции ДНК. Перемешивается на вортексе. Для лучшей элюции пробирка инкубируется в термостате при температуре 65°С в течение 5 мин с периодическим встряхиванием на вортексе.

8. Далее сорбент осаждается центрифугированием при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость, содержащая очищенную ДНК, готова к постановке ПЦР.

Раствор ДНК можно хранить при температуре -18°С в течение 6 месяцев.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амплификации нужного фрагмента гена 5.8S рРНК, выявляемого при помощи подобранных нами праймеров следующей структуры:

5′ CCACGATAGGGATCAGCGTT 3′,

5′ GAAAGTTTTAACTGATTTTGCTTG 3′.

Амплификацию специфичного фрагмента гена 5.8S рРНК проводят в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 1 мкл тотальной ДНК, 3 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы, по 1 мкл каждого праймера, 3 мкл dNTP и 1 мкл Taq-полимеразы.

Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°С в течение 2 мин; 30 циклов, включая денатурацию при 94°С - 20 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 61°С - 20 сек; элонгация при 72°С - 20 сек; терминальная элонгация - 1 мин.

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и после окрашивания геля бромидом этидия идентифицируют в ультрафиолетовом свете. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5 Х боратный буфер (0,089 М трисНСl, рН=7,9; 0,089 М борная кислота, 0,002 ЭДТА, рН=8,0).

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 100 В. Детекцию результатов проводят путем окрашивания агарозного геля бромистым этидием в течение 10-15 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Продукт амплификации размером 231 п.н. обнаруживается в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Больной И., 10 лет, поступил с жалобами на высыпания на волосистой части головы, сопровождающиеся зудом и болезненностью.

Анамнез: Заболевание заметили родители 15 дней назад. Пораженные участки смазывали настойкой йода. Заразился от коровы.

Status localis: Процесс поражения локализовался на коже волосистой части головы, где имелись на гиперемированном, отечном фоне один крупный очаг размером 10,5×8,5 см в диаметре и пять мелких отсевов по периферии. В виде полушаровидных, опухолевидных образований ярко-красного цвета, с множеством воспалившихся волосяных фолликулов. При надавливании из расширенных отверстий фолликулов появлялись капли гноя (Kerion Celsii), волосы отсутствовали, оставшиеся легко эпилировались. Шейные и затылочные лимфатические узлы были увеличены, болезненны. Отмечались повышение температуры и головная боль.

Результаты лабораторных исследований:

OAK лейкоциты - 9,0×10⁹/л, СОЭ 24 мм/ч.

Микроскопия: Т. ectothrix megaspores.

Посев: нет роста.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Trichophyton verrucosum фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Инфильтративно-нагноительная трихофития волосистой части головы (6 очагов).

Пример 2.

Больной В., 8 лет, поступил с жалобами на поражение кожи левой кисти.

Анамнез: Болен в течение 10 дней. Источник заражения не известен.

Status localis: Процесс поражения локализовался на коже тыла левой кисти, где имелся на отечном и гиперемированном фоне воспалительный инфильтрат округлой формы, размером 8-9 см в диаметре, занимающий всю поверхность тыла кисти. Края очага незначительно приподняты и состоят из пустул и папул, покрытые серозно-гнойными корками. Были резко увеличены регионарные лимфатические узлы.

Результаты лабораторных исследований:

OAK лейкоциты - 10,0×10⁹/л, СОЭ - 17 мм/ч, эозинофилия - 11%.

Микроскопия: С гладкой кожи споры не обнаружены. В пушковых волосах мицелий не обнаружен.

Посев: Tr. verrucosum.

Результаты ПНР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Trichophyton verrucosum фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Инфильтративно-нагноительная трихофития кожи левой кисти (1 очаг).

Таким образом, предлагаемый способ специфической детекции Trichophyton verrucosum в клиническом материале при различных клинических формах заболевания в отличие от микроскопического и культурального методов позволяет выявлять и идентифицировать мицелий и споры Trichophyton verrucosum в доступном клиническом материале при различных клинических формах заболевания (в особенности, при стертых и атипичных формах), что надежно коррелирует с результатами других исследований и, соответственно, обеспечивает единую интерпретацию данных.