СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ MICROSPORUM CANIS В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМАХ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, лабораторной микологии и дерматовенерологии, и может быть использовано для диагностики микроспории.

Дерматомикозы относятся к числу наиболее распространенных инфекций человека. Микроспория по распространенности занимает второе место после микозов стоп. Заболеваемость на территории РФ в 2009 году составила 45,2 на 100 тыс. населения, с максимумом среди детского населения (243,6⁰/₀₀₀₀). Имеются региональные отличия, обусловленные в определенной мере, как особенностями среды обитания на конкретных территориях, так и существенными отличиями качества диагностики, зачастую не позволяющими выявить стертые и атипичные их формы, которые являются причиной многочисленных диагностических ошибок [Степанова Ж.В. Клинические особенности и лечение микроспории в современных условиях / Ж.В. Степанова // Вестник дерматологии и венерологии. - 2008. - №6. - С. 85-88; High prevalence of tinea capitis in newly arrived migrants at an English-language school, Melbourne, 2005 / M.E. McPherson [et al.] // Med.J. Aust. - 2008. - Vol. 189, N 1. - P. 13-16.].

Их число в последние десятилетия существенно нарастает, чему способствует низкая чувствительность культурального метода диагностики микроспории и дерматофитий вообще, составляющая лишь 40-70% [Иванова, M.А. Грибковые заболевания кожи в Амурской области и других субъектах Российской Федерации, 2008-2009 гг. [Электронный ресурс] / M.А. Иванова, А.В. Гречко, Н.E. Мельниченко // Социальные аспекты здоровья населения: электронный научный журнал. - 2010. - №15. - Режим доступа: http://vestnik.mednet.ru; Малишевская, Н.П. Современные особенности эпидемиологии, клиники и лечения микроспории / Н.П. Малишевская, С.Н. Нестеров // Лечащий врач. - 2006. - №1. - С.90-92; Щелкунова О.А. Клинико-эпидемиологические особенности микроспории и трихофитии, подходы к лечению: дис. канд. мед. наук: 14.01.10 / О.А. Щелкунова. Новосибирск, гос. медицинский ун-т. - Новосибирск, 2013. - 18 с.; Исаева Т.И. Клинико-эпидемиологические и медико-социальные аспекты микроспории в различных климато-географических условиях: автореф. дис. …канд. мед. наук / Т.И. Исаева// М., 2009. - 25 с.; Иванова Ю.А. Клинико-микологический профиль поверхностных микозов в Алтайском краевом кожно-венерологическом диспансере / Ю.А. Иванова О.В. Райденко // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, №3. - С. 38-42.].

При подозрении на микроспорию основным методом лабораторной диагностики, как и при других дерматофитиях, является обнаружение возбудителя в исследуемом материале (частички кожи и волосы) [Микроспория в Краснодарском крае / В.В. Пархоменко [и др.] // Кубанский Научный медицинский вестник - 2011. - №2 (125). - С. 127-130]. Для этого в настоящее время применяются следующие методики [Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3.1 Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Лабора, 2009. - 880 с.]:

1. Микроскопия клинического материала - метод предварительной диагностики заболевания. В случаях отсутствия роста возбудителя в культуре положительный результат прямой микроскопии является единственным подтверждением микотической инфекции. Патологический материал изучают в нативных препаратах. Для просветления препаратов, т.е. для растворения роговых масс, используют 20% раствор едкой щелочи (КОН или NaOH).

2. Культуральный метод исследования до сих пор остается предпочтительным методом диагностики микозов. Осуществляется для окончательного уточнения диагноза и выяснения эпидемиологии. Он включает получение культуры гриба с последующим микроскопическим исследованием. По внешнему виду колоний на чашках Петри можно составить представление о роде возбудителя (Microsporum), его виде (Microsporum canis). Окончательное уточнение рода и вида гриба возможно только на основании микроскопического исследования полученной культуры.

3. При отборе материала также используют ультрафиолетовую лампу Вуда. Пораженные волосы светятся в ее лучах голубовато-зеленым цветом. Этот метод позволяет обнаружить волосы, пораженные микроспорумом, причем даже такие отдельные волоски, поражение которых обычно трудно уловить.

Однако все используемые методы имеют ряд существенных недостатков:

1. Микроскопия клинического материала не позволяет идентифицировать грибы в патологическом материале до вида по их морфологии. Кроме того, чувствительность этого метода недостаточна.

2. Культуральный метод исследования является очень трудоемким и занимает от 5 до 14 дней. Несмотря на то, что специфичность этого метода значительно выше, чем при микроскопии клинического материала, чувствительность этого метода тоже недостаточна.

3. Несмотря на то, что метод с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда считается эффективным при массовых обследованиях, лечение противогрибковыми мазями приводит к прекращению свечения, которое возобновляется только через 3-4 дня после тщательного мытья волос. Следовательно, использование этого метода приводит к получению большого числа ложноотрицательных результатов.

Эффективность перечисленных методов лабораторной диагностики не в полной мере отражает истинную ситуацию по заболеваемости микроспорией. Следовательно, для формирования наиболее объективных представлений о масштабах ее распространения, необходимо широкое внедрение в практику здравоохранения и ветеринарной службы молекулярно-генетических методов диагностики, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую отличает исключительно высокая чувствительность и специфичность, что позволит выявлять Microsporum canis в клиническом материале при различных формах заболевания и, в особенности, - при стертых и атипичных формах.

Известен способ диагностики дерматомикозов, заключающийся в том, что диагностику дерматомикозов осуществляют путем высева дерматофитов из клинического материала на плотную селективную среду Сабуро с добавлением антибиотика - левомицетина и гидролизата кератина, полученного из куриного пера. Питательная среда для выделения дерматофитов имеет следующий состав, г/л: глюкоза - 40,0; пептон - 10,0; агар - 18,0-20,0; гидролизат кератина (в пересчете на сухое вещество) - 10,0-20,0; левомицетин - 50000 ЕД; дистиллированная вода - остальное. Посев инкубируют при температуре 22-24°C в течение 4-8 дней с последующей идентификацией вида колоний. Способ наиболее эффективен при выделении из материала от больных культур грибов-дерматофитов, в частности Microsporum canis, Trichophyton vermcosum, Trichophyton mentagrophytes var. gypseum, Trichophyton rubrum [патент RU №2275631, 2006 г.].

Прототипом предлагаемого изобретения является способ диагностики онихомикоза кистей и стоп, сущность которого заключается в том, что грибок Trichophyton rubrum идентифицируют методом ПЦР, для чего выделяют ДНК из образца кожи или ногтевых пластинок, при этом для выделения ДНК образец инкубируют в 2-4 М растворе щелочи не менее 1 ч при температуре 50-65°C, нейтрализуют раствор 30%-ной соляной кислотой, переосаждают образец в 50%-ном растворе этанола при температуре минус 10 - минус 20°C и высушивают при температуре 50-65°C; проводят ПЦР ДНК с применением высокоспецифичных для гена 28 S РНК Trichophyton rubrum синтетических ДНК-зондов, имеющих последовательность: TR-1-F (смысловой): 5' atcgaatctttgaacgcaca 3'; TR-1-R (антисмысловой): 5' tataaagattggggccaggg 3' и при положительном результате диагностируют онихомикоз, вызванный грибком Trichophyton rubrum [патент RU №2319962, 2008 г.].

Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного и высокочувствительного способа детекции Microsporum canis при различных формах заболевания и, в особенности, при стертых и атипичных формах.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности лабораторной диагностики микроспории у человека за счет достоверного обнаружения мицелия и спор Microsporum canis вне зависимости от вида исследуемого клинического материала и формы заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе детекции Microsporum canis, включающем выделение тотальной нативной ДНК из клинического материала, представляющего образец кожи, проведение полимеразной цепной реакции, согласно изобретению в качестве клинического материала дополнительно используют волосы, проводят специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Microsporum canis с использованием праймеров следующей структуры:

5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',

5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3' и при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя.

Предлагаемый способ детекции Microsporum canis осуществляется следующим образом. Из клинического материала (частички кожи и волосы) выделяют тотальную нативную ДНК, после чего проводят специфическую амплификацию (ПЦР) фрагмента гена 5.8S рибосомальной РНК (рРНК) Microsporum canis с использованием праймеров следующей структуры:

5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',

5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3'.

При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. констатируют факт присутствия возбудителя в клиническом материале и подтверждают соответствующий диагноз.

ДНК выделяют из клинического материала (частички кожи и волосы). Для обеспечения необходимой степени чистоты ДНК и достаточного ее количества используют методику Boom R. [Boom R., et al. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J.Clin.Microbiol. 28: 495-503]:

1. В пробирку с 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидинтиоционат, 1% Triton X100) вносится 1 грамм исследуемого материала. Проба тщательно перемешивается на вортексе и прогревается 5 мин при температуре 65°C. Центрифугировали 5 сек при 5 тыс.об/мин на микроцентрифуге. Когда проба растворялась не полностью, пробирку центрифугировали на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс.об/мин. Надосадочная жидкость переносится в новую чистую пробирку.

2. Отдельным наконечником в пробирку вносят 25 мкл ресуспендированного сорбента (силикагель, SiO₂). Перемешивают на вортексе, ставят в штатив на 2 мин, еще раз перемешивают и оставляют в штативе на 5 мин.

3. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется с использованием вакуумного отсасывателя.

4. Далее в пробирку с сорбентом вносится 300 мкл раствора для отмывки (5М гуанидинтиоционат). Образовавшуюся смесь тщательно ресуспендируют на вортексе.

5. Сорбент осаждается центрифугированием при 5 тыс.об/мин на микроцентрифуге в течение 30 сек. Надосадочная жидкость удаляется, с помощью вакуумного отсасывателя и чистого наконечника.

6. Добавляется 950 мкл отмывочного раствора (70% этиловый спирт). Сорбент ресуспендируют на вортексе, центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель и чистый наконечник.

7. Пробирку инкубируют при температуре 65°C 5-10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышка пробирки должна быть открыта. В пробирку после подсушки добавляется 50 мкл ТЕ-буфера (1 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН 8.0) для элюции ДНК. Перемешивается на вортексе. Для лучшей элюции пробирка инкубируется в термостате при температуре 65°C в течение 5 мин с периодическим встряхиванием на вортексе.

8. Далее сорбент осаждается центрифугированием при 12 тыс.об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость, содержащая очищенную ДНК, готова к постановке ПЦР.

Раствор ДНК можно хранить при температуре -18°C в течение 6 месяцев.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и амплификации нужного фрагмента гена 5.8S рРНК выявляемого при помощи подобранных нами праймеров следующей структуры:

5' TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAA 3',

5' GGTCCTGGAGGCGATGGTATGTC 3'.

Амплификацию специфичного фрагмента гена 5.8S рРНК проводят в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 1 мкл тотальной ДНК, 3 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы, по 1 мкл каждого праймера, 3 мкл dNTP, и 1 мкл Taq-полимеразы.

Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°C в течение 2 мин; 25 циклов, включая денатурацию при 94°C - 20 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 64°C - 20 сек.; элонгация при 72°C - 10 сек; терминальная элонгация - 1 мин.

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле и после окрашивания геля бромидом этидия идентифицируют в ультрафиолетовом свете. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5 X боратный буфер (0,089 М трис-HCl, рН=7,9; 0,089 М борная кислота, 0,002 ЭДТА, рН=8,0).

Электрофорез проводят при постоянном напряжении 100 В. Детекцию результатов проводят путем окрашивания агарозного геля бромистым этидием в течение 10-15 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Продукт амплификации размером 182 п.н. обнаруживается в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Больной А., 5 лет, поступил с жалобами на высыпания на волосистой части головы, сопровождающиеся зудом.

Анамнез: Заболевание заметили родители 10 дней назад. Лечился самостоятельно йодом, без улучшения. Заразился от котенка.

Status localis: На коже волосистой части головы на гиперемированном и инфильтрированном фоне имеется крупный очаг размером 6×5,5 см в диаметре, округлой формы, четко отграниченный от здоровой кожи, розовато-красного цвета, покрытый толстым слоем серозно-гнойных чешуек и корок, масса пустул. В пределах пораженного участка волосы обломаны на уровне 5-6 мм.

Результаты лабораторных исследований:

OAK лейкоциты - 6,0×10⁹/л, СОЭ 15 мм/ч.

Микроскопия: Microsporum ectothrix.

Тест с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда: голубовато-зеленое свечение обломков волос.

Посев: нет роста.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Microsporum canis фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Микроспория волосистой части головы (1 очаг).

Пример 2.

Больной Т., 16 лет, поступил с жалобами на высыпания на предплечьях, сопровождающиеся зудом.

Анамнез: Болен около 3 недель. Лечился самостоятельно йодом и 3% серной мазью, без улучшения. Заразился от кошки.

Status localis: Процесс поражения локализовался на предплечьях, где имелось 15 очагов, округлой формы, красновато-розового цвета, различной величины со склонностью к слиянию. Кожа очагов умеренно инфильтрирована, отечна, со значительной пустулизацией на поверхности, покрыта гнойными корками.

Результаты лабораторных исследований:

Микроскопия: С гладкой кожи споры не обнаружены. В пушковых волосах мицелий не обнаружен.

Тест с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда: свечение отсутствует.

Посев: Microsporum canis.

Результаты ПЦР: в клиническом материале (частички кожи и волосы) методом полимеразной цепной реакции обнаружены и идентифицированы специфичные для Microsporum canis фрагменты гена 5.8S рРНК.

Окончательный диагноз: Распространенная микроспория гладкой кожи предплечий (15 очагов).

Таким образом, предлагаемый способ специфической детекции Microsporum canis в клиническом материале при различных формах заболевания, в отличие от микроскопического, культурального методов и теста с использованием ультрафиолетовой лампы Вуда позволяет выявлять и идентифицировать мицелий и споры Microsporum canis в доступном клиническом материале при различных формах заболевания (в особенности, при стертых и атипичных формах), что надежно коррелирует с результатами других исследований и, соответственно, обеспечивает единую интерпретацию данных.