Способ моделирования динамики опухолевого роста в эксперименте

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для моделирования динамики опухолевого роста в эксперименте.

Современные модели экспериментального изучения опухолевого процесса, выполненные на модели перевиваемых лабораторным животных аутологичных или аллогенных опухолей, во-первых, не учитывают эндокринный статус лабораторных животных, во-вторых, большинство прорабатываемых методов направлено на получение новых способов индукции торможения опухолевого роста, что в дальнейшем является основой для экстраполирования отработанных методик в реальную клиническую практику. Однако моделирование не только торможения опухолевого роста, но и ускорения «естественной истории развития опухоли» позволит экспериментально влиять на изменение агрессивности экспериментальных опухолей, что в логике научного познания на основе обратных звеньев патогенетических взаимоотношений может способствовать более глубокому пониманию процессов канцерогенеза. Экспериментальное влияние на эндокринный статус с целью моделирования степени биологической агрессивности перевиваемых опухолей является методикой, принципиально позволяющей изменять концентрации одних и тех же гормонов ниже и выше установленных или условных референсных значений. Данное положение в большей мере относится к гормонам щитовидной железы, которые влияют на рост, развитие и метастазирование опухолей. Йодотирониновые гормоны щитовидной железы: тироксин и трийодтиронин, - кроме прямого воздействия на ядерные рецепторы, активируют мембранные рецепторы клетки, расположенные на интегрине α_Vβ₃ (CD51/CD61), что в последующем приводит к активации митоген-активируемой протеин-киназы, фосфотидил-инозитол-3-киназы и серин-треониновой киназы. Таким образом, прямо пропорционально концентрации вышеуказанных гормонов в крови происходит активация опухолевого ангиогенеза [1], клеточной пролиферации [2] и миграционной способности клеток [3]. Таким образом, концентрация йодотиронинов может моделировать течение «естественного развития опухоли». Обобщая данные фундаментальной науки, можно сказать, что лекарственная индукция гипотиреоза приводит к снижению активности опухолевого ангиогенеза и пролиферации, а введение избыточных концентраций тиреоидных гормонов, наоборот, усиливает данные процессы.

Целью изобретения является моделирование динамики роста перевиваемой опухоли яичника в эксперименте с помощью изменения системного тиреоидного статуса путем введения тиреостатиков или L-тироксина.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что при данном способе моделирования динамики опухолевого роста в эксперименте, включающем системное изменение тиреоидного статуса, белым беспородным крысам массой 200-250 г внутрибрюшинно перевивают по 0,5 мл взвеси клеток рака яичника, содержащей не менее 1×10⁷ опухолевых клеток. Для ускорения опухолевого роста выполняется индукция лекарственного гипертиреоза путем введения L-тироксина в дозе 100±20 мкг на 100 г массы тела животного 1 раз в сутки, для торможения опухолевого роста выполняется индукция лекарственного гипотиреоза путем введения пропилтиоурацила в дозе 2,0±0,2 мг на 100 г массы животного 1 раз в сутки, при этом субстанции вводят внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд ежедневно, начиная за 3 дня до инокуляции опухолевых клеток; затем оценивают динамику роста опухоли и продолжительность жизни животных-опухоленосителей.

Техническим результатом предлагаемого нами способа является решение задачи, заключающейся в моделировании как торможения, так и ускорения динамики опухолевого роста посредством влияния на уровень содержания йодотиронинов в организме на примере перевиваемой асцитной опухоли яичника у беспородных крыс.

Преимущества предлагаемого нами способа заключается в его избирательном воздействии только на тиреоидный статус, что позволяет исключить другие системные влияния на «естественную историю развития опухоли».

Белым беспородным крысам массой 200-250 г, содержащимся в стандартных условиях вивария, внутрибрюшинно перевивают по 0,5 мл взвеси опухолевых клеток рака яичника (РЯ). Используется штамм перевиваемой опухоли яичника ранее полученного из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и созданного перевивкой РЯ от крысы, подвергшейся трансплацентарному воздействию канцерогена. Исходный гистологический тип опухоли - метастазирующая папиллярная аденокарцинома, в настоящее время - асцитная опухоль.

Для ускорения опухолевого роста производится индукция лекарственного гипертиреоза путем введения L-тироксина в дозе 100±20 мкг на 100 г массы тела животного 1 раз в сутки, для торможения опухолевого роста производится индукция лекарственного гипотиреоза путем введения пропилтиоурацила в дозе 2,0±0,2 мг на 100 г массы животного 1 раз в сутки. Субстанции вводятся внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд ежедневно, начиная за 3 дня до инокуляции опухолевых клеток.

Оценивают динамику роста опухоли и продолжительность жизни животных-опухоленосителей.

Пример осуществления предлагаемого способа.

Проведено несколько экспериментов на 225 самках беспородных крыс в возрасте 40±10 дней с начальной массой тела 200-250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Наблюдение за животными включало 3 группы лабораторных животных, из которых на двух группах воспроизведена модель индуцированного медикаментозного гипер- и гипотиреоза соответственно, а оставшаяся служила группой сравнения. После окончания карантина лабораторные животные были рандоминизированно распределены на три равные группы [4]. Работа проведена в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.) [5].

Модель перевиваемой опухоли яичника воспроизведена с использованием штамма РЯ, полученного из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и созданного перевивкой РЯ от крысы, подвергшейся трансплацентарному воздействию канцерогена. Исходный гистологический тип опухоли метастазирующая папиллярная аденокарцинома, в настоящее время асцитная опухоль. В данной серии экспериментов асцитная опухоль РЯ от поддерживающей рост опухоли особи перевивалась 7-9 крысам, не входящим в экспериментальные группы, для создания необходимого количества (накопления) перевиваемой культуры РЯ с необходимой концентрацией опухолевых клеток для 45 включенных в эксперимент лабораторных животных. После чего на 5-7-й день после внутрибрюшинной перевивки РЯ от этих лабораторных животных брали асцитную жидкость и после цитологической верификации опухоли и подсчета клеток перевивали лабораторным животным из каждой экспериментальной группы поочередно. Инокуляция асцитной жидкости, разведенной физиологическим раствором и содержащей не менее 1×10⁷ клеток, производилась внутрибрюшинно по 0,5 мл каждой особи.

В каждом эксперименте лабораторным животным на модели животных первой (гипертиреоидной) группы воспроизведена модель индуцированного лекарственного гипертиреоза, на второй (гипотиреоидной) группе - модель индуцированного пропилтиоурацилового гипотиреоза путем введения исследуемого вещества: L-тироксин (сухое вещество, РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) в дозе 100±20 мкг на 100 г массы тела животного 1 раз в сутки, пропилтиоурацил (сухое вещество, «Merck Selbstmedikation GmbH», Германия) 2,0±0,20 мг на 100 г массы животного 1 раз в сутки, - внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд ежедневно, начиная за 3 дня до инокуляции опухолевых клеток. После взвешивания лабораторных животных необходимое количество исследуемой субстанции растворяли в 2,0 мл индифферентного пищевого желатинового геля (HenanBoomGelatinCo., Ltd, КНР) и вводилось соответствующей особи. С целью создания одинакового стрессового фактора лабораторные животные группы сравнения также получали по 2,0 мл геля внутрижелудочно через зонд.

День перевивки РЯ был принят за нулевой, при этом при оценке продолжительности жизни животных последним днем жизни считался предыдущий день перед днем гибели. Противоопухолевые эффекты препаратов оценивали по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) крыс, сравнивая средние продолжительности жизни (СПЖ) в случае нормального распределения или медианы продолжительности жизни (МПЖ) при отсутствии нормального распределения относительно результатов выживаемости лабораторных животных [4]. УПЖ в относительных величинах (±%) рассчитывали по следующей формуле:

где СПЖ_О и СПЖ_С (МПЖ_О - СПЖ_С) - соответственно средняя продолжительность (медиана продолжительности) жизни крыс опытной группы и группы сравнения.

Сравнение между группами проводили с помощью t-критерия Стьюдента (различия достоверны при t>1,99). Статистический анализ показателей выживаемости проводили с использованием критерия Лиллиефорса, построение кривых выживаемости с определением МПЖ в каждой группе проводили по методу Каплана-Мейера, стандартную ошибку выживаемости - по формуле Гринвуда, анализ кривых выживаемости по тесту Мантела-Кокса (Log-ranktest). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Критерий Лиллиефорса, примененный к результатам выживаемости, продемонстрировал, что распределение не соответствует нормальному, поэтому выживаемость в группах сравнивали только по МПЖ для чего строили кривые выживаемости по методу Каплана-Мейера. Результаты выживаемости продемонстрированы в таблице 1.

Как следует из таблицы МПЖ в группе индуцированного гипо- и гипертиреоза достоверно отличались от условно эутиреоидной группы.

Список литературы:

1. Davis F.B., Mousa S.A., O'Connor L. et al. Proangiogenic action of thyroid hormone is fibroblast growth factor-dependent and is initiated at the cell surface // Circ. Res. 2004; 94 (11): 1500-1506.

2. Davis F.B., Tang H.Y., Shih A. et al. Acting via a cell surface receptor, thyroid hormone is a growth factor for glioma cells // Cancer Res. 2006; 66 (14): 7270-7275.

3. Глушаков Р.И., Прошин C.H., Тапильская Н.И. Роль тиреоидных гормонов в регуляции ангиогенеза, клеточной пролиферации и миграции // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011; 6 (1): 12-18.

4. А.Н. Миронов, Н.Д. Бунатян, А.Н. Васильев и др., Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, Гриф и К., Москва (2012), с. 642-657.

5. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes, Strasbourg, 18. III. 1986 (15.VI.2006), European Treaty Series, №123 (1986, 2006).