Результат интеллектуальной деятельности: ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ МОНОЦИТОВ IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для увеличения эффективности приготовления дендритноклеточных и Т-клеточных вакцин для терапии злокачественных новообразований.

Успехи в изучении природы злокачественных опухолей, выявление молекулярных и генетических признаков опухоли предопределяют поиск принципиально новых методов лечения, в основе которых лежит избирательное поражение клеток, генетически отличных от нормальных клеток организма. Одним из таких методов является иммунотерапия, которая основывается на активации и усилении процессов специфического иммунного ответа организма на развитие опухоли.

Этот метод заключается в активации ex vivo опухолевыми антигенами элементов иммунной системы с получением опухолеспецифических антител или эффекторных клеток с последующим их введением в организм больного.

На сегодняшний день существует большое количество препаратов антител, некоторые из которых уже прошли успешно клинические испытания. Однако значимого роста выживаемости пациентов не выявлено.

Еще одним потенциально эффективным направлением иммунотерапии является использование дендритных клеток (ДК). Дендритные клетки играют ключевую роль в регуляции приобретенного иммунитета, обеспечивая эффективную защиту организма против множества инфекций и различных патологий. Основная функция дендритных клеток заключается в поглощении чужеродных антигенов, их процессирование и презентация антигенных детерминант эффекторным клеткам иммунной системы. В контексте онкологических заболеваний дендритные клетки являются крайне перспективными терапевтическими агентами, благодаря возможности презентации специфических опухолевых антигенов и активации противоопухолевого ответа в организме пациента.

В связи с этим получение функционально-активных ДК in vitro и активация их опухоль-ассоциированными антигенами для стимуляции цитотоксического ответа является одним из приоритетных направлений при разработке противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток, поскольку позволяет мобилизовать защитные системы организма больного, используя естественные пути распознавания опухолевых антигенов и их последующую элиминацию.

В виду низкого содержания дендритных клеток в крови человека, стандартная схема приготовления дендритно-клеточных вакцин предполагает дифференцировку моноцитов периферической крови пациента в дендритные клетки под воздействием набора цитокинов (Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения, Чкадуа Г.З. и др., Российский биотерапевтический журнал, т. 1, №3, 2002, стр 56-62. В дальнейшем полученные подобным образом дендритные клетки нагружаются очищенным препаратом специфического опухолевого антигена или тотальным лизатом опухолевых клеток.

Наиболее оптимальным способом загрузки опухолевых антигенов является трансдукция дендритных клеток антиген-содержащими вирусными векторами, обеспечивающими высокоэффективную презентацию антигенов молекулами главного комплекса гистосовместимости первого класса (MHCI). Как правило, для трансдукции используют лентивирусные векторы на основе вируса иммунодефицита человека 1 типа HIV1, которые позволяют интегрировать целевую последовательность в геномную ДНК клетки, тем самым обеспечивая постоянный и стабильный уровень экспрессии антигена.

В частности, из уровня техники известны клетки, сконструированные для экспрессии, по меньшей мере, одного цитокина и, по меньшей мере, одного антигена, который индуцирует самодифференцирование клеток-предшественников дендритной клетки (DC) в функциональные антигенпрезентативные индуцированные DC (iDC). Как особо предпочтительный указан лентивирусный вектор, который имеет мутантную интегразу с последовательностью нуклеиновой кислоты (заявка WO 2014122035 (А2).

Однако применение лентивирусных векторов для создания дендритно-клеточных вакцин ограничено низкой эффективностью трансдукции дендритных клеток.

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pCI-UB-POLYEPI, - прототип настоящего изобретения, содержащая эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для колоректального рака, и способ ее применения для стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток колоректального рака. Также известно использование дендритных клеток, трансфицированных ДНК-конструкцией, кодирующей иммуногенные эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов СЕА, ЕрСАМ и MUC4, что является эффективным способом стимуляции цитотоксического потенциала мононуклеарных клеток (патент РФ №2507265).

Задачей настоящего изобретения является создание генетической конструкции, позволяющей более эффективно приготовить на ее основе дендритноклеточные и Т-клеточные вакцины для терапии злокачественных новообразований.

Задача решается новой плазмидной конструкцией, содержащей регуляторные элементы лентивирусного вектора для трансдукции периферических моноцитов и дендритных клеток, а также экспрессионную кассету, обеспечивающую полицистронную экспрессию транскрипционных факторов с-Мус и BMI1 под контролем клеточного промотора EF1 alpha.

Таким образом объектом изобретения является генетическая конструкция на основе экспрессионного плазмидного лентивирусного вектора, кодирующая последовательность транскрипционного фактора с-Мус, саморасщепляющийся пептид Т2А и последовательность транскрипционного фактора BMI1, а также ряд регуляторных элементов: 5' и 3' LTR (long terminal repeat), Rev (RRE или Rev-response element), Env - регуляторную последовательность, обеспечивающую упаковку вирусного генома в структуру вирусной частицы с образованием вириона, сРРТ - центральный полипуриновый тракт, WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) и промотор EF1 alpha, предназначенная для индукции пролиферации моноцитов и дендритных клеток, полученных из периферической крови человека. Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1 - Лентивирусный вектор pLEF1a-tagRFP

Фиг. 2 - Схематичное изображение генетической конструкции, содержащей последовательности транскрипционных факторов с-Мус и BMI1 для экспрессии под контролем клеточного промотора EF1a

Фиг. 3 - Динамика изменения численности дендритных клеток, трансдуцированных экспрессионным конструктом pLEF1a-cMyc-T2A-BMI1 и контрольных образцов, в ходе культивации ex vivo.

Техническим результатом изобретения является обеспечение эффективной конститутивной экспрессии транскрипционных факторов с-Мус и BMI1 конструкцией, при введении которой в периферические моноциты и дендритные клетки, эти клеточные популяции начинают проявлять пролиферативную активность, и могут быть экспансированы при культивации ex vivo. Изобретение иллюстрируют следующие примеры:

Пример 1. Получение генетической конструкции

В качестве основы для создания генетической конструкции, содержащей последовательности транскрипционных факторов с-Мус и BMI1, используют лентивирусный вектор pLEF1a-tagRFP структуры указанной на Фиг. 1.

В представленный вектор методом клонирования по сайтам рестрикции редкощепящими эндонуклеазами встраивают следующие нуклеотидные последовательности:

Последовательность, кодирующая транскрипционный фактор с-Мус

SEQ ID №1

Последовательность саморасщепляющегося пептида Т2А

SEQ ID №2

Последовательность, кодирующая транскрипционный фактор BMI1

SEQ ID № 3

Указанные последовательности вводят с 3'-конца от промоторной области фактора элонгации 1 альфа (EF1alpha).

Вводимые последовательности нарабатывают методом ПЦР из кДНК, полученной путем обратной транкрипции мРНК, выделенной из периферических мононуклеарных клеток здорового донора. После амплификации последовательностей, кодирующих транскрипционные факторы, проводят бридж-ПЦР для получения слитого конструкта, состоящего из последовательности с-Мус, следующего за ней саморасщепляющегося пептида Т2А и следующей за ним последовательности транскрипционного фактора BMI1. Разделение амплифицированных фрагментов проводят в ходе горизонтального электрофореза в агарозном геле. Для очистки ДНК-фрагментов используют набор Clean Up Mini (Евроген, Россия). Очищенный слитой фрагмент ДНК и лентивирусный вектор pLEF1a-tagRFP обрабатывают эндонуклеазами рестрикции XbaI и SpeI, в результате чего из лентивирусного вектора вырезают последовательность красного флуоресцентного белка tagRFP, после чего проводят еще один этап очистки рестрикционных смесей в агарозном геле. На завершающем этапе проводят лигирование полученных генетических последовательностей и экспрессионного вектора. Правильность ориентации вставки в итоговом векторе контролируют при помощи диагностической ПЦР с праймерами EF1a seq dir и BMI Spe stop rev. Анализ нуклеотидной последовательности полученной генетической конструкции проводят методом секвенирования, доказавшим успешность проведенного клонирования. Результатом работы стало получение генетической конструкции, содержащей последовательности транскрипционных факторов с-Мус и BMI1 для экспрессии под контролем клеточного промотора EF1a; структура генетической конструкции представлена на фиг. 2.

Пример 2. Структура генетической конструкции, содержащей последовательности транскрипционных факторов с-Мус и BMI1 для экспрессии под контролем клеточного промотора EF1a

В состав заявленной генетической конструкции входят последовательности, кодирующие транскрипционные факторы с-Мус и BMI1 а также саморасщепляющуюся пептидную последовательность, обеспечивающую полицистронную экспрессию транскрипционных факторов под контролем одного промотора; и ряд регуляторных последовательностей, обеспечивающих эффективную сборку лентивирусного вектора в псевдовирусные частицы и необходимых для успешной интеграции экспрессионной кассеты в геном клетки.

Регуляторные последовательности

5' и 3' LTR (long terminal repeat) - длинные концевые повторы, последовательности ДНК, обеспечивающие внедрение вирусного генома в геном клетки-хозяина при участии фермента интегразы.

Rev (RRE или Rev-response element) - регуляторная последовательность, обеспечивающая транспортировку молекулы вирусной мРНК из ядра в цитоплазму, где происходит ее экспрессия.

Env - регуляторная последовательность, обеспечивающая упаковку вирусного генома в структуру вирусной частицы с образованием вириона.

сРРТ - центральный полипуриновый тракт - последовательность, которая способствует проникновению обратно-транскрибируемой вирусной ДНК в ядро клетки, обеспечивая тем самым заражение митотически неактивных клеток.

WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) - энхансер - последовательность, обеспечивающая формирование особой пространственной структуры трансгена и увеличивающая вероятность распознавания промоторного региона факторами траскрипции. Кроме того, увеличивает стабильность мРНК трансгена.

Промотор EF1 alpha. Эффективный промотор, обеспечивающий высокий уровень экспрессии во многих типах клеток.

Экспрессируемые последовательности

с-Мус - последовательность транскрипционного фактора Мус, кодируемого человеческим геном MYC.

Т2А - 2А последовательность из вируса Thosea asigna, саморасщепляющийся пептид, необходимый для разделения аминокислотных последовательностей транскрипционных факторов сразу после трансляции.

BMI1 - последовательность транскрипционного фактора BMI1 из белков группы Polycomb.

Пример 3. Сравнение динамики численности дендритных клеток в ходе культивации после введения экспрессионного конструкта pLEF1a-cMyc-T2A-BMH относительно нетрансдуцированных ДК

Для определения влияния введения экспрессионного конструкта pLEF1a-cMyc-T2A-BMI1 на активацию пролиферации дендритных клеток, полученных из периферических моноцитов путем дифференцировки путем культивации в присутствие ростовых факторов интерлейкина-4 и гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора, дендритные клетки, трансдуцированные pLEF1a-сМус-Т2А-BMI1, культивируют в течение 4 недель. В качестве контроля, в параллели проводят культивирование дендритных клеток, не подвергавшихся лентивирусной трансдукции, в таком же количестве и плотности. Раз в неделю проводят подсчет количества клеток при помощи люминесцентного субстрата Celltiter-Glo 2.0. Динамика численности дендритных клеток, трансдуцированных экспрессионным конструктом pLEF1a-cMyc-T2A-BMI1 и контрольных образцов, представлена на фиг. 3.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности действия экспрессионного конструкта pLEF1a-cMyc-T2A-BMI1 на стимуляцию пролиферации периферических дендритных клеток, что указывает на высокую практическую ценность pLEF1a-cMyc-T2A-BMI1 для получения больших количеств функционально-активных дендритных клеток, что может быть востребовано для приготовления дендритноклеточных и Т-клеточных вакцин, использующихся для клеточной иммунотерапии.