СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в иммунотерапевтических и исследовательских целях для эффективного получения генетически модифицированных цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих химерные рецепторы к заданному антигену.

Псевдотипирование лентивирусных векторов - широко используемая в генной инженерии практика, позволяющая повысить тропизм вирусных частиц к специфическим антигенам и увеличить эффективность трансдукции отдельных типов клеток. Особую актуальность данный метод приобретает при введении генетических конструкций в лимфоциты, в силу неспособности лентивирусов инфицировать так называемые «спящие» Т-лимфоциты покоя, не имеющие антигенной специфичности. Псевдотипирование лентивирусных векторов путем замены гликопротеина Env на гетерологичные гликопротеины вируса кори позволяет обойти это ограничение и добиться эффективной трансдукции Т-клеток, независимо от фазы клеточного цикла.

Проникновение в клетку вакцинного штамма вируса кори опосредовано двумя поверхностными гликопротеинами: гемаглютинином Н, специфично взаимодействующим с рецепторами заражаемой клетки (SLAM, CD46 и проч.) и белком слияния F, обеспечивающим связывание оболочки вируса с плазматической мембраной. Присутствие CD46 и SLAM рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов обеспечивает эффективность трансдукции клеток этого типа Н- и F-псевдотипированными лентивирусными частицами.

В настоящее время разработаны различные алгоритмы доставки генетических конструкций при помощи лентивирусных векторов, псевдотипированных гликопротеинами вируса кори, наиболее близким к заявленному изобретению по технической сущности и результатам, достигаемым аналогами, являются технические решения, описанные в заявках: WO 2000055335 A1, WO 2011085247 A2 и ЕР 2615176 А1.

Применение существующих на сегодняшний день методик сопряжено с рядом ограничений, обусловленных, главным образом, спецификой наработки вируса. Основная проблема возникает в силу того, что, то время как спектр экспрессии SLAM (CD150/SLAM) ограничен незрелыми тимоцитами, Т- и В-лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками, рецептор CD46 присутствует на поверхности всех ядерных клеток в организме человека. На практике это приводит к тому, что заражению вирусом оказываются подвержены эукариотические упаковывающие клетки, используемые в ходе лабораторных методик наработки лентивирусных вирионов, псевдотипированных гликопротеинами Н и F. После трансдукции клеток-упаковщиков белок F вируса кори, экспрессирующийся на цитоплазматической мембране зараженной клетки, опосредует ее слияние с окружающими клетками, в результате приводя к формированию синцития - многоядерного клеточного образования, препятствующего дальнейшей пролиферации клеток и приводящее к их гибели. Заражение рекомбинантным вирусом CD46-позитивных клеток упаковывающей линии также приводит к значительному снижению титра вируса в силу его повторной реабсорбции из культуральной среды клетками упаковывающей линии.

Альтернативным решением проблемы заражения клеток линии-упаковщика нарабатываемым вирусом является техническое решение, приведенное в заявке ЕР 2615176 А1 являющейся одним из ближайших аналогов изобретения и описывающей использование лентивирусного вектора, псевдотипированного F и Н белками парамиксовирусов. Указанная проблема решается за счет таргетного изменения аминокислотной последовательности Н белка, делающего невозможным его взаимодействие с соответствующими лигандами (CD46, SLAM, nectin4). Вместе с тем, методика, реализуемая данным аналогом, ограничивает дальнейшее применение нарабатываемого вируса, не позволяя использовать ее для решения задач, решаемых заявленным изобретением, в частности, для трансдукции CD46-позитивных лимфоцитов, являющихся ключевым инструментом иммунотерапии.

Известно техническое решение WO 2000055335 A1, раскрывающее способ получения псевдотипированных лентивирусных векторов, которые могут быть использованы для доставки целевых генов (в частности, генетических последовательностей, кодирующих структуру CAR) в клетки широкого спектра клеточных культур, предусматривают использование в качестве линии-упаковщика для наработки лентивирусных частиц, псевдотипированных гликопротеинами вируса кори, линий HEK293 (primary human embryonic kidney cells) и PMK (primary monkey kidney cells), не предполагая их генетической модификации с целью подавления экспрессии CD46.

Задачей, на решение которой было направлено заявленное изобретение, является создание эффективного метода наработки рекомбинантных лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори, в ходе которого не происходило бы заражения рекомбинантным вирусом клеток упаковывающей линии.

Решением данной задачи является разработка методики получения цитотоксических Т-лимфоцитов, включающей этап создания клеточной линии упаковщика с нарушенной экспрессией рецептора CD46. Трансгенные CD46-дефицитные клетки не будут подвержены заражению лентивирусными частицами, псевдотипированными гетерологичными гликопротеинами вируса кори, что позволит добиться высокой эффективности получения рекомбинантного вируса, используемого для получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Технической задачей изобретения является оптимизация процесса получения цитотоксических Т-лимфоцитов, имеющих потенциал использования в терапевтических и исследовательских целях, с помощью повышения эффективности наработки рекомбинантных лентивирусных частиц, за счет сведения к минимуму негативных эффектов формирования синцития и реабсорбции вируса клетками упаковывающей линии. Заявленное техническое решение характеризуется научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентными преимуществами для получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные рецепторы.

Разработанная методика получения цитотоксических Т-лимфоцитов, включающая этап создания клеточной линии упаковщика с нарушенной экспрессией клеточного рецептора CD46

1. Получение CD46-дефицитной линии HEK293T.

a. Подбор in silico и последующий синтез (приобретение) короткой последовательности направляющей РНК (sgPHK), обладающей уникальным сродством к 5' экзонам CD46.

b. Клонирование подобранной короткой последовательности направляющей РНК в генетический вектор, кодирующий последовательность эндонуклеазы Cas9 и репортерный ген (tag GFP).

c. Оценка эффективности клонирования в ходе секвенирования по Сэнгеру.

d. Трансфекция клеток линии HEK293T полученной генетической конструкцией.

e. Анализ флуоресценции, отбор и экспансия RFP-позитивных клонов.

f. Оценка эффективности нокаута CD46 в ходе иммуноферментного анализа.

2. Получение лентивируса, псевдотипированного поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори.

g. Трансфекция CD46-дефицитной линии HEK293T генетическими конструкциями, кодирующими структуру Т-клеточного химерного рецептора и двумя упаковочными плазмидами, несущими гены гликопротеинов F и Н.

h. Наработка и выделение вируса

i. Определение титра вируса

3. Трансдукция Т-клеток наработанным рекомбинантным лентивирусом, псевдотипированным поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори.

Осуществление изобретения

I. Получение CD46-дефицитной линии HEK293T

Первым этапом достижения технического результата стало создание экспрессионной конструкции для экспрессии фермента CRISPR/Cas9 и направляющей РНК (sgРНК), комплементарной участку экзона-1 гена CD46 для эффективного подавления экспрессии рецептора CD46 (Фиг. 1, 2).

Подобранная последовательность направляющей РНК была клонирована в вектор pCas-Guide-PVR1-P2A-tagRFP под контроль промотора U6 (Фиг. 3).

Анализ нуклеотидной последовательности полученной генетической конструкции анализировали методом секвенирования по Сэнгеру, доказавшим успешность проведенного клонирования.

Полученной генетической конструкцией были трансфицированы клетки линии HEK293T. Изоляция и экспансия успешно трансфицированных клонов была проведена на основе уровня флуоресценции репортерного гена tagRFP, входящего в состав вектора pCas-Guide-PVR1-P2A-tagRFP.

II. Получение лентивирусных частиц, псевдотипированных поверхностными гликопротеинами вакцинного штамма вируса кори

Клетки CD46-дефицитной линии HEK293T были котрансфецированы тремя плазмидами: генетической конструкцией, кодирующей структуру Т-клеточного химерного рецептора (Фиг. 4) и двумя упаковочными плазмидами, несущими гены гликопротеинов F и Н (Фиг. 5 и 6, соответственно).

Ростовую среду с трансфицированных клеток, содержащую рекомбинантные вирионы, собирали через 36 часов, фильтровали через 0.44 мкм стерильные фильтры (Millipore) и использовали для трансдукции Т-лимфоцитов.

III. Трансдукция Т-клеток наработанным рекомбинантным лентивирусом

Заражение Т-лимфоцитов проводили из расчета 10 вирусных частиц на 1 клетку. Процесс заражения проводили в течение 8 часов, в бессывороточной питательной среде AIM-V, после чего клетки осаждали центрифугированием и рассаживали на свежую порцию питательной среды AIM-V. В результате работ получали популяцию цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Анализ эффективности разработанной методики получения цитотоксических Т-лимфоцитов

Конкурентное преимущество предложенной методики базируется на возможности получения высокого титра рекомбинантного вируса, нарабатываемого в CD46-дефицитной линии HEK293T. Соответственно, анализ эффективности изобретения включал в себя оценку нокаута CD46 в HEK293T и последующий расчет титра вируса, нарабатываемого трансгенными клетками этой линии в сравнении с CD46-позитивной линией HEK293T, используемой в качестве упаковщика ближайшими аналогами заявленной разработки.

Эффективность нокаута CD46 была подтверждена в ходе иммуноферментного анализа (Фиг. 7).

Определение титра вирусных частиц проводили методом предельных разведений с последующим анализом количества зараженных клеток в ходе проточной цитометрии. Последовательность работ включала наработку препаратов рекомбинантного лентивируса, псевдотипированного гетерологичными гликопротеинами вируса кори в CD46 (-) и исходной CD46 (+) линиях HEK293T, и дальнейшее заражение различными разведениями сопоставляемых препаратов модельной культуры клеток. Через 48 часов после заражения, осуществляли цитометрический анализ клеточных культур. Расчет титра вируса проводился с использованием следующей формулы: титр={(F × Cn) /V} × DF, где F - количество флуоресцирующих клеток, Cn - общее количество клеток, V - объем добавленного препарата, DF - фактор разведения вируса.

Результаты определения титра вирусных частиц, полученных при наработке вируса в клетках в CD46-дефицитной линии HEK293T, представлены в табл.1, соответствующие результаты для исходной линии HEK293T обобщены в табл. 2.

На основе представленных данных был рассчитан титр вируса, составивший:

- 2×10⁸ вирусных частиц/мл для CD46-дефицитной линии HEK293T и

- 2,8×10⁷ вирусных частиц/мл для исходной линии HEK293T.

Значительный прирост титра наработанного вируса в случае использовании CD46-дефицитной линии HEK293T подтверждает конкурентное преимущество разработанной методики и позволяют рекомендовать ее для эффективного получения цитотоксических Т-лимфоцитов.

Изобретение иллюстрировано следующим графическим материалом:

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность CD46-специфичной направляющей РНК

Фиг. 2 - Схема участка экзона-1 гена CD46, комплементарного подобранной направляющей РНК

Фиг. 3 - Схематичное изображение вектора pCas-Guide-PVR1-P2A-tagRFP

Фиг. 4 - Схематичное изображение генетической конструкции, кодирующей структуру

Т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечных VHH-антител, специфичных к опухолевому рецептору CD47

Фиг. 5 - Схематическое изображение генетической конструкции pMD2-Fd30

Фиг. 6 - Схематическое изображение генетической конструкции pCD-4AHcd24

Фиг. 7 - Результаты иммуноферментного анализа эффективности нокаута CD46 в клетках линии HEK293T

Табл. 1 - Результаты определения титра вирусных частиц, полученные при наработке вируса в клетках в CD46-дефицитной линии HEK293T

Табл. 2 - Результаты определения титра вирусных частиц, полученные при наработке вируса в клетках в CD46-позитивной линии HEK293T