Способ активации регенерационного потенциала эпителия трахеи старых крыс при общем охлаждении организма

Изобретение предназначено для использования в биологии и медицине.

Уровень ответной реакции организма на экстремальное воздействие находится в прямой зависимости от потенциальных возможностей стволовых клеток к пролиферации и дифференцировке [6, 9, 10]. При старении организма регенерационный потенциал понижается как в результате уменьшения числа стволовых клеток, так и за счет снижения их способности к размножению, что часто наблюдается в эпителиальных тканях. Генетическая нестабильность, развивающаяся в ходе старения организма, часто сопровождается сбоями в системах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты. Накопление соматических мутаций в результате воздействия эндогенных метаболитов продуктов ПОЛ может рассматриваться как один из механизмов старения клеток [3].

Дигидрокверцетин - антиоксидант растительного происхождения, по своим химическим свойствам является исключительно активным веществом. В результате многоплановых исследований установлено, что дигидрокверцетин ингибирует свободнорадикальное окисление как водорастворимых так и жирорастворимых субстратов [1, 5]. Выявлена способность дигидрокверцетина препятствовать перерождению нормальных клеток в патологические. Дигидрокверцетин обладает чрезвычайно низкой токсичностью и мутагенной активностью. При воспалительных заболеваниях бронхолегочной системы было показано усиление процессов ПОЛ за счет инициирования активных форм кислорода. Наиболее важным в развитии патологических процессов в легких является интенсификация свободнорадикального окисления и снижения антиоксидантной защиты [1, 5]. Действие общего охлаждения на организм при старении ведет к значительным изменениям пролиферативных процессов в эпителии, что возможно способствует извращению дифференцировки эпителиоцитов [4, 8].

Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является создание способа, позволяющего использовать дигидрокверцетин в виде перорального введения, с целью активации процесса регенерации эпителия трахеи при общем охлаждении организма у старых животных.

Сущность изобретения заключается в том, что способ активации регенерационного процесса эпителия трахеи старых крыс при общем охлаждении организма включает ежедневное использование дигидрокверцетина, минимально в течение 14 дней до начала холодового периода, в дозе 5 мг/ 100 г, перорально.

Изобретение поясняется рисунками: Фиг. 1 - Слизистая оболочка трахеи крысы. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим. Увеличение 1000; а) При общем охлаждении организма, в) При применении дигидрокверцетина на фоне общего охлаждения, где 1 - реснитчатая клетка; 2 - светлая реснитчатая клетка; 3 - базальная клетка; 4 - ядро базальной клетки; 5 - экструзия; (↓) - гранулы сульфида свинца в мембране клетки. Фиг. 2 -Электроннограмма базальной клетки эпителия трахеи. Реакция по Mayahara с соавт.. Заливка аралдит, эпон. Окраска уранил ацетатом, цитратом свинца. Увеличение: 12000; а) при общем охлаждении организма, в) при применении дигидрокверцетина на фоне общего охлаждения, где 1 - реснитчатая клетка; 2 - светлая реснитчатая клетка; 3 - базальная клетка; 4 - ядро базальной клетки; 5 - экструзия; (↓) - гранулы сульфида свинца в мембране клетки.

Для подтверждения результата было проведено исследование с использованием крыс - самцов с массой тела 200-230 грамм, возрастом 19-20 месяцев. Животные были распределены на 3 группы: I. Интактные - содержались в условиях вивария; И. Контрольные - животные, которые подвергались охлаждению в течение 14 дней по 3 часа ежедневно при Т-15°С; III. Экспериментальные - животным в течение 14 дней перорально вводили дигидрокверцетин из расчета 5 мг/100 г, затем их подвергали общему холодовому воздействию в течение 14 дней по 3 часа ежедневно при Т-15°С, продолжая введение препарата во время всего холодового эксперимента.

Объект исследования: эпителий слизистой оболочки трахеи и периферическая кровь.

В исследовании применялись методы: морфологический, электронно-микроскопический, биохимический. Морфометрический анализ проводили путем изучения эпителия трахеи, измерения осуществлялись на полутонких срезах, окрашенных метиленовым синим. Соотношение различных элементов эпителия определяли при подсчете на 1000 клеток. Дифференцировали клеточные элементы на основании структуры ядра и его места расположения. На электронограммах проводили измерения площади и ядра базальной клетки. С целью изучения локализации и активности щелочной фосфомоноэстеразы применяли свинцовый метод электронной гистохимии по Mayahara с соавт. [2]. Для оценки процессов перекисного окисления липидов в ходе эксперимента определяли содержание диеновых коньюгатов, гидроперекисей липидов, малонового диальдегида. Состояние антиоксидантной системы оценивали по содержанию витамина Е и церулоплазмина [7].

У интактных животных клеточный состав эпителия трахеи имеет типичный план строения. Реснитчатый слой равномерный, но выявляются участки, где реснички практически отсутствуют. Встречаются реснитчатые клетки, имеющие светлую вакуолизированную цитоплазму. В эпителии выявляются умеренные явления экструзии, в основном представленные промежуточными клетками. Бокаловидные клетки более многочисленны, чем у молодых животных. Продукты реакции на щелочную фосфомоноэстеразу в виде мелких гранул, которые четко контурируют границы базальных клеток.

У животных второй группы наблюдается изменение структуры эпителия, появляются многочисленные реснитчатые клетки со светлой цитоплазмой и дистрофическими изменениями ядра (Фиг. 1а). Достоверно увеличивается число бокаловидных клеток. Число базальных клеток снижается, размер ядра и площадь самой клетки достоверно уменьшается (Табл. 1). Реакция на щелочную фосфомоноэстеразу (маркера базальных клеток) имеет грубую очаговую локализацию в мембранах (Фиг. 2а). Достоверно повышается уровень экструзии эпителиоцитов. При общем охлаждении организма в периферической крови, достоверно повышаются диеновые конъюгаты, гидроперекиси и малоновый диальдегид на фоне снижения уровня показателей антиоксидантной защиты (Табл. 2).

Применение дигидрокверцетина на фоне общего охлаждения приводит к умеренному росту числа реснитчатых клеток, которые в основном имеют типичное строение (Фиг. 1в). Число и параметры базальных клеток возрастают (Табл. 1). В составе их мембран выявляются многочисленные равномерно расположенные гранулы продуктов реакции на щелочную фосфомоноэстеразу (Фиг. 2в). Снижается уровень экструзии эпителиоцитов. На фоне охлаждения при применении дигидрокверцетина в периферической крови выявлено снижение количества продуктов ПОЛ и особенно малонового диальдегида. Показатели витамина Е и церулоплазмина достоверно возрастают (Табл. 2).

*р<0,05, **р<0,01 - уровень доверительной вероятности при сравнении I и II групп

^р<0,05, ^^р<0,01 - уровень доверительной вероятности при сравнении II и III групп

*р<0,05, **р<0,01 - уровень доверительной вероятности при сравнении I и II групп

^р<0,05, ^^р<0,01 - уровень доверительной вероятности при сравнении II и III групп

Таким образом, как положительный момент действия дигидрокверцетина на фоне охлаждения, можно расценить снижение интенсивности реакций ПОЛ и активации веществ антиоксидантной защиты. О повышении митотической активности в эпителии свидетельствует рост числа базальных клеток, увеличение размера самой клетки и ее ядра, повышение активности щелочной фосфомоноэстеразы (маркера стволовых клеток), а также снижение числа эпителиоцитов в состоянии апоптоза и экструзии. Полученные данные указывают, что применение этого препарата весьма эффективно и может быть использовано у пациентов старческого возраста, т.к. снижение активности

свободнорадикальных процессов замедляет темп возрастной инволюции. Данный препарат может применяться с целью геропрофилактики. Длительное воздействие антиоксидантом способно замедлить физиологическое старение, предотвратить появление повреждений в генетическом аппарате продуктами ПОЛ.

Технический эффект использования изобретения заключается в том, что просто и доступно, путем перорального приема препарата дигидрокверцетин, можно оказывать модулирующее воздействие на регенерационный процесс эпителиальной выстилки слизистой оболочки трахеи. Это дает основание рекомендовать его также для использования в качестве средства, облегчающего процесс адаптации, особенно у пожилых лиц.

Список литературы

1. Владимиров, Ю.А. Дигидрокверцетин (таксифолин) и другие флавоноиды как ингибиторы образования свободных радикалов на ключевых стадиях апоптоза / Ю.А. Владимиров, Е.В. Проскурнина, Е.М. Демин, Н.С. Матвеева, О.Б. Любицкий, А.А. Новиков, Д.Ю. Измайлов, А.Н. Осипов, В.П. Тихонов, В.Е. Каган // Биохимия. - 2009. - Т. 74, Вып. 3. - С. 372-379.

2. Гайер, Г. Электронная гистохимия / Г. Гайер. - М: Изд-во «Мир», 1974. - С. 288-289.

3. Гусев, В.А. Свободнорадикальная теория старения в парадигме геронтологии / В.А. Гусев // Успехи геронтологии - 2000. - Вып.4. - С. 271-272.

4. Круглова, О.Г. Влияние дигидрокверцетина на продукты перекисного окисления липидов при холодовом воздействии / О.Г. Круглова, В.А. Доровских, В.И. Тиханов, Т.Г. Круглова, И.А. Бочарникова // Дальневосточный медицинский журнал. - 2011. - №3. - С. 90-92.

5. Мажитова, М.В. Возрастные и половые особенности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты плазмы крови белых крыс / М.В. Мажитова, Д. Д. Теплый // Экспериментальная физиология, морфология и медицина. - 2010. - №1. - С. 79-85.

6. Стадников, А.А. Стволовые клетки и репаративная регенерация в постнатальном онтогенезе млекопитающих / А.А. Стадников, А.Н. Шевлюк // Морфология. - 2006. - №6. - С. 84-88.

7. Стальная, Е.А. Метод определение диеновой конъюгаты ненасыщенных высших жирных кислот / Е.А. Стальная // Современные методы в биохимии. - М.: «Медицина», 1977. - С. 63-64.

8. Целуйко, С.С. Современные взгляды на вопросы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток органов дыхания в норме и при Холодовых воздействиях / С.С.Целуйко, Н.П. Красавина, Д.А. Семенов, М.М. Горбунов, С.Д. Чжоу, Ц. Ли // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2012. - Вып. 45. - С. 98-102.

9. Kotton, D.N. Lung stem cells / D.N. Kotton, Fine A. // Cell and Tissue Research. - 2008. - №331. - P. 145-156.

10. Rawlins, E.L. Epithelial stem cells of the lung: Privileged few or opportunities for many / E.L. Rawlins, B.L.M. Hogan // Development. - 2006. - №133. - P. 2455-2465.